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    茄子單性結(jié)實(shí)候選基因的表達(dá)分析

    2011-08-14 03:25:32劉富中李香景陳鈺輝張振賢方智遠(yuǎn)
    中國(guó)蔬菜 2011年16期
    關(guān)鍵詞:品系茄子開(kāi)花

    張 映 劉富中 李香景 陳鈺輝 張振賢 方智遠(yuǎn) 連 勇

    (1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京100081)

    茄子(Solanum melongenaL.)是喜溫作物,在溫室反季節(jié)栽培及春季露地早熟栽培條件下,開(kāi)花期常由于低溫引起授粉受精不良,落花、落果,效益降低。茄子單性結(jié)實(shí)能克服低溫引起的落花落果障礙,坐果能力增強(qiáng),產(chǎn)量顯著提高,同時(shí)還可改進(jìn)果實(shí)品質(zhì),降低栽培成本(劉富中 等,2005;張映 等,2009)。因此,茄子單性結(jié)實(shí)特性的研究及單性結(jié)實(shí)基因的分離與克隆,對(duì)指導(dǎo)單性結(jié)實(shí)品種的育種工作,選育耐低溫、適宜保護(hù)地和露地早春栽培、優(yōu)質(zhì)無(wú)籽或少籽的茄子品種,具有重要的意義。目前,國(guó)內(nèi)外研究者先后對(duì)茄子單性結(jié)實(shí)的特性(田時(shí)炳 等,1999;劉富中 等,2005)、內(nèi)源激素的種類(lèi)和含量變化(武彥榮 等,2009;張偉春 等,2009)、胚胎及果實(shí)發(fā)育的解剖特點(diǎn)(張偉春 等,2008)、遺傳規(guī)律(田時(shí)炳 等,2003;劉富中 等,2008)、AFLP分子標(biāo)記(劉富中 等,2008;Shimomura et al.,2010)進(jìn)行了研究,并通過(guò)轉(zhuǎn)入外源嵌合基因DefH9-iaaM獲得轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)茄子(Rotino et al.,1997),但有關(guān)茄子單性結(jié)實(shí)形成的分子機(jī)制和單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因的分離克隆尚未見(jiàn)報(bào)道。

    筆者利用SSH技術(shù)構(gòu)建了茄子單性結(jié)實(shí)果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的抑制差減cDNA文庫(kù),含有2 347個(gè)陽(yáng)性克隆,測(cè)序、序列拼接后,共獲得1 248個(gè)高質(zhì)量的unigenes。本試驗(yàn)對(duì)獲得的差異表達(dá)unigenes在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析,并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù),研究10個(gè)差異表達(dá)unigenes在不同結(jié)實(shí)性果實(shí)中的表達(dá)特性,以期獲得茄子單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因,為進(jìn)一步克隆茄子單性結(jié)實(shí)基因,深入研究茄子單性結(jié)實(shí)基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    茄子單性結(jié)實(shí)自交系D-10:在開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在7~15 ℃之間時(shí),表現(xiàn)單性結(jié)實(shí),果實(shí)內(nèi)無(wú)種子,果實(shí)正常生長(zhǎng)發(fā)育;當(dāng)溫度適宜后,植株上部果實(shí)內(nèi)產(chǎn)生種子。非單性結(jié)實(shí)自交系03-2:在開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在7~15 ℃之間時(shí),果實(shí)不能正常膨大 (劉富中 等,2005)。試驗(yàn)材料于2009年春定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)地內(nèi)。門(mén)茄開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在9~15 ℃之間,單性結(jié)實(shí)特性完全表達(dá),產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí),非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)不能正常膨大。四門(mén)斗開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在 16~21 ℃之間,單性結(jié)實(shí)特性不表達(dá),兩品系都產(chǎn)生正常有籽果實(shí)。分別取兩品系低溫時(shí)期(門(mén)茄)和適宜溫度時(shí)期(四門(mén)斗)開(kāi)花前7 d、開(kāi)花當(dāng)天、開(kāi)花后7 d和開(kāi)花后20 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的子房或果實(shí),迅速用液氮冷凍處理,置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 RNA的提取和cDNA的合成

    單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系的門(mén)茄和四門(mén)斗時(shí)期各取樣時(shí)間點(diǎn)均取 3個(gè)子房或果實(shí)作為一份材料,液氮研磨,用Omega的Plant RNA Kit提取總RNA。用1.0 %變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性,利用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定其濃度和純度。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)合格的RNA取5 μg,應(yīng)用SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)合成cDNA第一鏈。

    1.3 差減文庫(kù)序列分析

    將測(cè)序結(jié)果去除載體和引物序列以后,使用Phrap軟件對(duì)Clean ESTs序列進(jìn)行組裝得到unigenes,將unigenes在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析,將比對(duì)結(jié)果E值低于1e-5的unigenes視為已知基因。

    1.4 差異表達(dá)序列熒光定量PCR分析

    以番茄ubiquitin為內(nèi)參基因(Cooper et al.,2004),選取 F1、Z351、Z358、Z569、Z599、Z603、Z613、Z622、Z626、Z707共10個(gè)差異表達(dá)unigenes,根據(jù)其核苷酸序列,應(yīng)用Primer Premier5.0軟件,設(shè)計(jì)退火溫度為57 ℃左右,引物無(wú)錯(cuò)配、二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu),產(chǎn)物為400 bp以下的基因特異引物,并將其在oligo 6里進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物的有效性和特異性。

    反應(yīng)在LightCycler480熒光定量PCR儀(Roche)上進(jìn)行,所有PCR都設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)體系:總體積20 μL,模板8 μL,上下游引物各1 μL,SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性 10 min,95 ℃ 10 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,45 個(gè)循環(huán)后作熔解曲線(xiàn)(95~65 ℃,0.1 ℃·s-1),實(shí)驗(yàn)所用的方法為雙標(biāo)法(唐永凱和賈永義,2008)。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:將ss cDNA(單鏈cDNA)模板按5-1、5-2、5-3、5-4、5-5的梯度濃度稀釋?zhuān)謩e擴(kuò)增內(nèi)參基因和差異表達(dá)序列,根據(jù)其 CT值獲得內(nèi)參基因和差異表達(dá)序列的擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)D-10和03-2的門(mén)茄和四門(mén)斗時(shí)期各取樣時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)序列和內(nèi)參基因的 CT值,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到不同結(jié)實(shí)性果實(shí)中不同時(shí)期的差異表達(dá)序列的相對(duì)表達(dá)量,使用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 差異表達(dá)EST序列的比對(duì)分析

    對(duì)所構(gòu)建的抑制差減cDNA文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆,經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接獲得1 248個(gè)unigenes,其中singletons 981個(gè),contigs 267個(gè)。將1 248個(gè)unigenes在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST比對(duì),比對(duì)結(jié)果中E值低于1e-5的有1 109個(gè),占全部unigenes的88.86 %;與其他物種同源性低或者沒(méi)有可匹配的同源基因的unigenes所代表的可能是新基因,共139個(gè),占11.14 %。筆者構(gòu)建的茄子單性結(jié)實(shí)SSH-cDNA文庫(kù)中部分unigenes的BLAST結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 SSH-cDNA文庫(kù)中的部分unigenes BLAST結(jié)果

    2.2 熒光定量PCR基因特異引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)從構(gòu)建的抑制差減文庫(kù)中挑選出的10條差異表達(dá)的unigenes的核苷酸序列(表2),利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)退火溫度為57 ℃,產(chǎn)物小于400 bp的基因特異引物,以番茄ubiquitin為內(nèi)參基因(Cooper et al.,2004),經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確認(rèn)其能有效擴(kuò)增,且擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶,表明設(shè)計(jì)的引物具有特異性(表2),可用于熒光定量PCR分析。

    表2 熒光定量PCR所用的基因特異性引物

    2.3 相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

    10個(gè)unigenes均以u(píng)biquitin基因作為內(nèi)參基因,作相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以梯度稀釋的模板進(jìn)行PCR,構(gòu)建各差異表達(dá)unigene和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并計(jì)算擴(kuò)增效率(表3)。各差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)都呈很好的線(xiàn)性關(guān)系,擴(kuò)增效率都大于0.9,適合進(jìn)行熒光定量比較。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程,可以計(jì)算出要驗(yàn)證的10個(gè)unigenes的相對(duì)表達(dá)量。

    2.4 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

    為了更準(zhǔn)確地鑒定SSH文庫(kù)中差異表達(dá)基因的可靠性,推測(cè)單性結(jié)實(shí)的形成機(jī)理,選取9個(gè)已知功能的 unigenes(F1、Z351、Z569、Z599、Z603、Z613、Z622、Z626、Z707)和 1個(gè)功能未知的unigene(Z358)(表1),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在單性結(jié)實(shí)品系D-10和非單性結(jié)實(shí)品系03-2果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況(圖1)。由圖1可知,10個(gè)unigenes的表達(dá)情況大致可分為 3類(lèi):在單性結(jié)實(shí)品系D-10中特異表達(dá)的 unigenes,包括 Z358、Z569、Z599、Z603、Z626和Z707;在非單性結(jié)實(shí)品系03-2適溫條件下特異表達(dá)的unigenes,包括F1和Z613;在單性結(jié)實(shí)和非單性結(jié)實(shí)品系中非特異性表達(dá)的unigenes,包括Z351和Z622。

    Z569在單性結(jié)實(shí)品系低溫(門(mén)茄)和適溫(四門(mén)斗)時(shí)期果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中具有相同的表達(dá)規(guī)律。在開(kāi)花前表達(dá)量逐漸升高,開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高,至開(kāi)花后7 d,表達(dá)量逐漸減少,開(kāi)花后7~20 d,表達(dá)量變化不大。Z569在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下的表達(dá)量高于在適溫條件下的表達(dá)量。Z569在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下(門(mén)茄)開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高,約為適溫條件下單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)中表達(dá)量的 2倍,為非單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下表達(dá)量的3.08倍。因此,Z569可能在低溫下單性結(jié)實(shí)果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中起重要的作用。

    Z599在單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式不同。在單性結(jié)實(shí)品系中,開(kāi)花前的表達(dá)量高于開(kāi)花后的表達(dá)量,開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高;而在非單性結(jié)實(shí)品系中,表達(dá)量隨子房和幼果的發(fā)育逐漸下降。Z707在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下開(kāi)花前的表達(dá)量逐漸下降,從開(kāi)花當(dāng)天起又逐漸升高,開(kāi)花后7 d表達(dá)量最高,之后又逐漸下降,而在非單性結(jié)實(shí)品系的果實(shí)和單性結(jié)實(shí)品系適溫下的有籽果實(shí)的開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高,表明 Z707在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下特異表達(dá)。

    在低溫條件下,Z603在單性結(jié)實(shí)品系中的表達(dá)量低于在非單性結(jié)實(shí)品系的表達(dá)量;而Z626在單性結(jié)實(shí)品系中的表達(dá)量高于非單性結(jié)實(shí)品系。Z358在單性結(jié)實(shí)品系不同結(jié)實(shí)性果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)模式是逐漸下降,在低溫條件下開(kāi)花前7 d的表達(dá)量變化不大;在非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)模式是在開(kāi)花前逐漸上升,開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高,開(kāi)花后表達(dá)量逐漸下降。

    F1在03-2四門(mén)斗有籽果實(shí)的開(kāi)花前7 d和開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量高于其他3種果實(shí),在開(kāi)花后7 d和20 d,4種不同結(jié)實(shí)性果實(shí)的表達(dá)量基本相同。Z613在03-2四門(mén)斗有籽果實(shí)中的表達(dá)模式是在開(kāi)花前7 d至開(kāi)花后7 d表達(dá)量逐漸減少,之后逐漸升高,在開(kāi)花后7 d表達(dá)量最低。而在其他3種果實(shí)中的表達(dá)模式則是完全相反,先上升后下降,在開(kāi)花后7 d表達(dá)量最高。

    表3 差異表達(dá)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及其擴(kuò)增效率

    圖1 差異表達(dá)unigenes相對(duì)定量分析

    Z351和Z622在單性結(jié)實(shí)和非單性結(jié)實(shí)品系不同果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律基本相同,其表達(dá)模式是下降—升高—下降,Z351在開(kāi)花后7 d表達(dá)量最高(圖1)。

    3 結(jié)論與討論

    本試驗(yàn)對(duì)前期構(gòu)建的茄子單性結(jié)實(shí)抑制差減文庫(kù)中的一些重要的差異表達(dá) unigenes序列進(jìn)行分析,這些基因編碼的產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MADS-box transcription factor和AP2/ERF transcription factor,果實(shí)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 pistil extension-like protein、methionine fulfoxide reductase和3-ketoacyl-CoA synthase,細(xì)胞組分histone H3.2 precursor和ribosomal protein,以及與植物成花相關(guān)的光受體Cryptochrome和Prf interactor等,涉及到果實(shí)發(fā)育的多個(gè)方面。獲得部分與其他物種同源性低或沒(méi)有可匹配的同源基因的 ESTs,可能是新基因。這些基因的功能有待進(jìn)一步研究。

    本試驗(yàn)得到的在單性結(jié)實(shí)子房和果實(shí)中上調(diào)表達(dá)的Z569,與控制番茄果實(shí)膨大的E4基因同源性高達(dá)89 %,其翻譯產(chǎn)物是甲硫氨酸亞砜還原酶(Cordes et al.,1989)。E4基因在膨大的果實(shí)中表達(dá)量高(即合成甲硫氨酸亞砜還原酶),在突變的番茄品種rin(果實(shí)膨大受阻型)中,E4基因的轉(zhuǎn)錄水平只有正常果實(shí)的1/10(DellaPenna et al.,1989)。這是因?yàn)樵谂虼蟮墓麑?shí)中代謝旺盛,產(chǎn)生大量的活性氧,活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的失衡和組織的損壞,由于甲硫氨酸亞砜還原酶的修復(fù)作用,保護(hù)了果實(shí)膨大過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白,使果實(shí)得以正常生長(zhǎng)和發(fā)育(Sadanandom et al.,2000)。熒光定量分析表明,在低溫條件下,單性結(jié)實(shí)品系D-10門(mén)茄開(kāi)花當(dāng)天子房中的Z569表達(dá)量最高,為非單性結(jié)實(shí)品系03-2門(mén)茄子房中表達(dá)量的3.08倍,約為單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系適溫條件下四門(mén)斗有籽果實(shí)表達(dá)量的2倍。前期試驗(yàn)表明,單性結(jié)實(shí)品系D-10的單性結(jié)實(shí)性受低溫誘導(dǎo)表達(dá)(劉富中 等,2005),其單性結(jié)實(shí)果實(shí)的形成可能是Z569基因的大量表達(dá),消除了低溫脅迫環(huán)境下(Berlett & Stadtman,1997)和果實(shí)膨大過(guò)程中(Dann & Pell,1989)產(chǎn)生的大量破壞性活性氧對(duì)一系列蛋白、脂肪和核酸的氧化作用,使子房正常發(fā)育成果實(shí)。因此推測(cè)Z569與單性結(jié)實(shí)相關(guān)。

    Z707與乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑末端的乙烯響應(yīng)因子序列為同源序列,乙烯響應(yīng)因子作為表達(dá)調(diào)控因子,調(diào)控下游具有 GCC-box元件的基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)性狀的表達(dá)和脅迫的響應(yīng)(安豐英和郭衛(wèi)紅,2006)。近年來(lái)在擬南芥和番茄中的研究證明,乙烯可通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素的作用以及通過(guò)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用引起果實(shí)的自發(fā)膨大,形成單性結(jié)實(shí)(Vivian-Smith,2000;Linet al.,2008)。Z707在低溫條件下的單性結(jié)實(shí)品系中開(kāi)花前下調(diào)表達(dá),開(kāi)花后上調(diào)表達(dá),其可能通過(guò)調(diào)控乙烯的表達(dá)促進(jìn)果實(shí)的發(fā)育。

    Z599與番茄中軟木脂和果皮表面的蠟粉合成有關(guān)的3 -酮脂酰輔酶A合成酶相似(Leide et al.,2007);Z603與組蛋白H2A相似,H2A具有維持核小體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和染色質(zhì)凝聚的作用,還可作為調(diào)節(jié)因子綁定到特需的蛋白質(zhì)上,調(diào)節(jié)基因的表達(dá);Z626是一種光敏色素相互作用因子,通過(guò)光信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)環(huán)境條件的改變發(fā)生響應(yīng)(Jiaoet al.,2007)。熒光定量分析表明,Z599和 Z358在單性結(jié)實(shí)品系中特異表達(dá),在低溫條件下,Z603在單性結(jié)實(shí)品系子房和果實(shí)的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中下調(diào)表達(dá),Z626上調(diào)表達(dá)。這3個(gè)unigenes與功能未知的Z358在茄子果實(shí)中的具體功能、作用機(jī)制以及是否與單性結(jié)實(shí)相關(guān)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

    F1和Z613在03-2適溫條件下的四門(mén)斗果實(shí)中特異表達(dá),可能與03-2四門(mén)斗果實(shí)中的種子數(shù)量最多有關(guān)。BLAST結(jié)果顯示F1與番茄中的單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因Tm29相似性高達(dá)90 %,轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和反義技術(shù)證明其可以引起單性結(jié)實(shí)(Ampomah-Dwamena et al.,2002)?;騎m29與擬南芥中的MADS-box基因家族中的SEPALLATA1、SEPALLATA2和SEPALLATA3基因具有相似性,已從擬南芥中分離出與胚珠發(fā)育密切的SEP基因(Favaroet al.,2003),研究發(fā)現(xiàn)若使SEP的活性減少,其正常的胚珠和種子的發(fā)育被打亂,一些胚珠變成葉狀或心皮狀的結(jié)構(gòu),這些結(jié)果表明SEP基因?qū)τ谡5呐咧榘l(fā)育是必須的。因此,茄子單性結(jié)實(shí)果實(shí)中種子的缺失,可能是控制胚珠發(fā)育的SEP基因活性減小引起的。Z613與隱花色素同源,隱花色素在響應(yīng)外界環(huán)境、開(kāi)花調(diào)控和基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面都具有重要作用(張小冰,2010),但其表達(dá)模式的改變是否調(diào)控果實(shí)的發(fā)育和種子的形成還需進(jìn)一步研究。

    非特異性表達(dá)的ungenes Z351和Z622則可能與單性結(jié)實(shí)無(wú)關(guān)。

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