四川省攀西地區(qū)南瓜、甜菜和辣椒部分病毒種類的ELISA檢測(cè)

楊會(huì)房 阮 濤 包凌云 于云奇 楊水英 青 玲

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病害生物學(xué)重慶市高校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

攀西地區(qū)自然條件得天獨(dú)厚，是四川省主要的蔬菜生產(chǎn)基地，但隨著南瓜、番茄、甜菜及辣椒等蔬菜的種植面積不斷擴(kuò)大及種植年限的增加，病毒病的危害也日趨嚴(yán)重。了解這些蔬菜上的病毒種類、變化趨勢(shì)及復(fù)合侵染情況，對(duì)于有針對(duì)性地制定以抗病育種為中心的綜合防治措施具有重要指導(dǎo)意義。為此，筆者在攀枝花、西昌及德昌地區(qū)對(duì)甜菜、辣椒和南瓜病毒病進(jìn)行了調(diào)查和取樣，利用蔬菜上常見的6種植物病毒的特異性血清對(duì)樣品進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，并對(duì)樣品中存在的病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

2010年4月從四川攀枝花、德昌和西昌等市蔬菜種植區(qū)采集了表現(xiàn)花葉癥狀的南瓜、甜菜和辣椒病毒病樣品共計(jì)87份，保存于- 80 ℃冰箱。

參考青玲等（2005）的方法，采用抗原直接包被ELISA法對(duì)樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)。煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）及蠶豆萎蔫病毒2號(hào)（Broad bean wilt virus 2，BBWV-2）相應(yīng)的抗原及單克隆抗體由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所周雪平教授惠贈(zèng)，馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）的抗原及多克隆抗體由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒實(shí)驗(yàn)室保存，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG購自美國Promega公司。

2 結(jié)果與分析

對(duì)采集的樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，在87份樣品中共有72份樣品可與6種供試血清中的1種或多種血清發(fā)生不同程度的陽性反應(yīng)（表1）。其中，PVY在攀枝花、西昌和德昌等3個(gè)地區(qū)樣品中的檢出率均最高，總檢出率達(dá)74.71 %；其次為TuMV，總檢出率為22.99 %；BBWV-2的總檢出率最低，為10.34 %；CMV、TMV和PVX的總檢出率分別為12.64 %、13.79%和14.94 %；表明PVY在該地區(qū)南瓜、辣椒及甜菜上的侵染最普遍（表1）。

在72份ELISA檢測(cè)呈陽性的樣品中，僅發(fā)現(xiàn)TuMV、PVX及PVY等3份病毒的單獨(dú)侵染。另有25份樣品檢測(cè)到2種以上病毒的復(fù)合侵染，陽性檢出率為34.72 %。值得一提的是同時(shí)檢測(cè)到6種病毒復(fù)合侵染的樣品在72份陽性樣品中所占比例為8.33 %。特別是攀枝花地區(qū)，檢測(cè)到6種病毒復(fù)合侵染的樣品在攀枝花地區(qū)的陽性樣品總數(shù)中所占比例達(dá)到20.00 %；且南瓜樣品中的病毒復(fù)合侵染情況較為嚴(yán)重，有28.57 %的南瓜陽性樣品受6種病毒復(fù)合侵染；與之相反，在該地區(qū)甜菜樣品上卻沒有檢測(cè)到任何病毒復(fù)合侵染的類型。此外，在德昌地區(qū)辣椒樣品上僅發(fā)現(xiàn)一種病毒復(fù)合侵染類型，即BBWV-2和PVY的復(fù)合侵染，其在陽性樣品中的總檢出率為2.78 %（表2）。

6種病毒在不同地區(qū)的分布有明顯差異。PVY在西昌地區(qū)的檢出率最高，為96.55 %；在攀枝花地區(qū)的檢出率最低，為40.63 %。與之相反，其余5種病毒在攀枝花地區(qū)的檢出率均明顯高于西昌和德昌地區(qū)。6種病毒對(duì)不同寄主的侵染率也有所不同。其中，在甜菜和辣椒上，PVY的檢出率分別為93.87 %和92.31 %，屬優(yōu)勢(shì)病毒種類。但在南瓜上6種病毒的檢出率較接近，且 TuMV的檢出率略高于PVY，表明在南瓜上 PVY并不是優(yōu)勢(shì)毒原。另外，辣椒上檢測(cè)到的病毒種類最少，僅檢出BBWV-2和PVY（表1）。在采樣過程中發(fā)現(xiàn)，西昌與德昌甜菜地周邊雜草叢生，且大多與茄科蔬菜間作。蚜蟲是病毒的重要傳播媒介，雜草和茄科蔬菜又是大多蔬菜病毒的常見寄主，因此，西昌與德昌甜菜上的病毒很可能來源于這些寄主和媒介昆蟲。攀枝花甜菜采集地田間管理較規(guī)范，因而其上病毒種類較少可能與此有關(guān)。

在本試驗(yàn)中，有15份樣品未檢測(cè)到上述6種病毒，分別為攀枝花地區(qū)南瓜樣品11份，攀枝花地區(qū)甜菜樣品1份，西昌地區(qū)甜菜樣品1份，德昌地區(qū)辣椒和甜菜樣品各1份，這些樣品病毒病癥狀均明顯。由于所用抗血清種類有限，因而這些樣品中可能仍含有其他病毒種類未被檢測(cè)出。此外，本試驗(yàn)所用PVY的血清是多抗，故PVY的高檢出率也可能與檢測(cè)結(jié)果存在假陽性有關(guān)。由于采樣較分散，品種沒有代表性，因而本試驗(yàn)未能反映品種與抗病性之間的關(guān)系。

表1 攀西地區(qū)蔬菜病毒病毒原的ELISA檢測(cè)

表2 病毒復(fù)合侵染的類型和比例

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)攀西地區(qū)采集的87份南瓜、辣椒和甜菜病毒病樣品進(jìn)行了針對(duì)PVY、PVX、CMV、TMV、BBWV-2及TuMV等蔬菜上常見的6種植物病毒的ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，共有72份樣品檢測(cè)呈陽性。其中PVY的侵染最普遍，總檢出率高達(dá)74.71 %，是該地區(qū)辣椒和甜菜上的優(yōu)勢(shì)毒原。但在南瓜上TuMV的檢出率略高于PVY，不同于以往報(bào)道（李鳳梅，2002；楊國慧，2003；青玲 等，2010；文朝慧 等，2010）。由于田間病毒類型常處于動(dòng)態(tài)變化中，這也可能是病毒病優(yōu)勢(shì)毒原變化趨勢(shì)的客觀反映。已有研究表明，辣椒、甜菜和南瓜上的病毒種類很多（席德慧 等，1999；李鳳梅，2002；楊國慧，2003；柴偉國 等，2006；青玲 等，2010），由于本試驗(yàn)受到采集樣品數(shù)量及地域的限制，且僅對(duì) 6種植物病毒進(jìn)行了檢測(cè)，因而無法涵蓋引起該地區(qū)甜菜、南瓜和辣椒病毒病的所有毒原。此外，有15份樣品檢測(cè)呈陰性，但病毒病的癥狀明顯，不能排除感染其他病毒種類的可能性，還需進(jìn)一步的鑒定。

在72份陽性樣品中，僅發(fā)現(xiàn)TuMV、PVX及PVY等3種病毒的單獨(dú)侵染，且主要是PVY的單獨(dú)侵染。另有25份樣品檢測(cè)到2種以上病毒的復(fù)合侵染，且復(fù)合侵染的病毒類型復(fù)雜。其中，南瓜上病毒的復(fù)合侵染很嚴(yán)重，這與已有報(bào)道的結(jié)果一致（青玲 等，2010）。另外，辣椒上檢出的病毒種類較少，這與筆者對(duì)重慶辣椒病毒病的檢測(cè)結(jié)果相一致（待發(fā)表），是否與寄主RNA沉默機(jī)制相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

柴偉國，朱麗萍，陳集雙. 2006. 杭州地區(qū)辣椒病毒病病原分子鑒定．上海蔬菜，（5）：78-80.

李鳳梅．2002．黑龍江省南瓜病毒病毒原鑒定和品種資源抗性篩選的研究〔博士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

青玲，劉映紅，馬麗娜．2005．武隆煙區(qū)煙草病毒病的病原初步鑒定．西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，27（3）：319-322．

青玲，包凌云，周常勇，楊水英，孫現(xiàn)超．2010．重慶南瓜病毒病病原ELISA檢測(cè)、CMV亞組鑒定及CMV CP基因序列變異性分析．園藝學(xué)報(bào)，37（3）：405-412．

文朝慧，劉志杰，張麗萍，劉箐，王軍平，劉雅莉，宋蕤，施穎波，侯健雄．2010．甘肅省河西地區(qū)辣（甜）椒病毒病毒原鑒定．中國蔬菜，（16）：74-78．

席德慧，向本春，陳衛(wèi)東，黃家風(fēng)，劉升學(xué)，謝浩．1999．新疆甜菜病毒病毒原類型的初步鑒定．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，（3）：97-99．

楊國慧．2003．滇黑兩省南瓜病毒病病原鑒定及其外殼蛋白基因克隆〔博士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．