• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    HIF-1α、HSP90在胰腺癌組織芯片中的表達(dá)及其臨床意義

    2011-08-14 05:17:36干文娟馮一中李峰
    中國癌癥雜志 2011年8期
    關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞胰腺癌胰腺

    干文娟 馮一中 李峰

    1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,江蘇 蘇州 215006;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系,江蘇 蘇州 215123;3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科,江蘇 蘇州 215004

    缺氧是實體腫瘤生長過程中普遍存在的一種現(xiàn)象,腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性與缺氧有關(guān),介導(dǎo)缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者是缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1),HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成。其中HIF-1a是HIF-1的活性亞基,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展和預(yù)后預(yù)測中具有重要意義,目前對于HIF-1α在胰腺癌中表達(dá)情況的研究國內(nèi)外還鮮見報道。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是生物體中普遍存在的高度保守的蛋白質(zhì),其主要的生物學(xué)功能是在應(yīng)激狀態(tài)下與靶蛋白形成復(fù)合體,以調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能,但又不參與靶蛋白的組成。因此,HSP又被稱為“分子伴侶”或“伴侶蛋白”。HSP90是分子伴侶中一組較為獨特的蛋白質(zhì),除了作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、運輸和合成過程以外,還能和一系列參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的激酶分子和突變蛋白質(zhì)相結(jié)合,并調(diào)節(jié)它們的穩(wěn)定性,從而影響多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

    HSP90在胰腺癌中的過表達(dá)可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[1]。本研究利用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化方法檢測胰腺癌組織中HIF-1α、HSP90蛋白的表達(dá)及其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,探討HIF-1α、HSP90在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及對預(yù)后的影響。

    1 資料和方法

    1.1 臨床資料

    收集本校附屬醫(yī)院及部分外院1993年—2007年胰腺癌手術(shù)標(biāo)本和臨床資料齊備者88例,所有患者均未給予術(shù)前放療、化療,且腫瘤組織均制備組織切片并行HE染色,并由2名病理醫(yī)師采用雙盲法確診為胰腺導(dǎo)管腺癌,其中位于胰頭者64例,胰體尾部者24例;男性59例,女性29例,年齡39~80歲,中位年齡62.50歲;腫瘤直徑≤4 cm者45例,>4 cm者43例;按照1997年國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進:Ⅰ期29例,Ⅱ期11例,Ⅲ期27例,Ⅳ期21例。組織學(xué)分級為:高分化腺癌17例,中分化腺癌50例,低分化腺癌21例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例。88例患者中有53例獲得隨訪資料,隨訪時間為2個月~6年,平均隨訪時間為(13.32±10.35)個月。其中死亡數(shù)為48例,生存(截尾數(shù)據(jù)) 數(shù)為5例。另外選取11例同時期非腫瘤性胰腺組織手術(shù)標(biāo)本作為對照。

    1.2 方法

    1.2.1 組織芯片的制作

    標(biāo)本均為4%甲醛溶液固定,常規(guī)組織處理、石蠟包埋。采用手工制作組織芯片,所用組織芯片制作儀為Instrumendics公司產(chǎn)品,取樣針直徑1.5 mm,組織芯間距1.0 mm。組織芯片制作步驟見文獻[2]。

    1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測

    對HIF-1α、HSP90分別采用SABC法、EnVision染色法,染色步驟按產(chǎn)品說明書進行,DAB顯色,一抗HIF-1α多克隆抗體(BA-0912)及二抗生物素化羊抗兔IgG抗體均購自Santa Cruz公司,HIF-1α抗體的工作濃度為1∶50,羊抗兔IgG抗體為即用型抗體。HSP90α/β(N-17)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,工作濃度為1∶100,即用型EnVision試劑(HRP/Rabbit)購于丹麥Dako公司。用PBS代替一抗作為陰性對照,用已知陽性的胰腺癌切片作為陽性對照。

    1.2.3 免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果判定

    用雙盲法由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師分別對免疫組化染色結(jié)果進行評估。鏡檢顯示胞質(zhì)或胞核染為淡黃色至棕黃色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。HIF-1α蛋白的陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì),少數(shù)定位于細(xì)胞核,HSP90在細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核均有表達(dá),以胞核表達(dá)為主。在高倍鏡(×400)下對每張切片隨機選擇5個視野,每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,共計1 000個。參照Gustavo等[3]的方法,綜合染色強度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進行半定量處理;根據(jù)染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)為:沒有染色為0分;弱染色但強于陰性對照為1分;中度染色為2分;強染色為3分;根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的評分標(biāo)準(zhǔn)為:無陽性細(xì)胞數(shù)為0分;不足34%陽性細(xì)胞數(shù)為1分;34%~66%陽性細(xì)胞數(shù)為2分;>66%陽性細(xì)胞數(shù)為3分。上述評分結(jié)果兩項相乘,0~6分為低表達(dá),>6分為高表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    統(tǒng)計軟件使用SPSS 13.0軟件包。HIF-1α、HSP90蛋白在非腫瘤性胰腺組織及胰腺癌各臨床參數(shù)之間表達(dá)差異的比較采用四格表資料的χ2檢驗。用Spearman秩相關(guān)進行HIF-1α、HSP90蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。對有隨訪資料的HIF-1α、HSP90的表達(dá)作出Kaplan-Meier生存曲線,各組間生存率用log-rank檢驗進行組間生存率的比較,HIF-1α、HSP90的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系采用單因素Cox回歸模型進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 組織芯片

    成功制備胰腺癌組織芯片蠟塊1個,為11×9點組織列陣,含99個位點,無組織芯脫落(圖1A)。組織芯片切片HE染色顯示所有位點組織結(jié)構(gòu)保存良好,無明顯壞死組織,組織芯片排列整齊(圖1B)。

    2.2 HIF-1α與HSP90蛋白表達(dá)

    2.2.1 HIF-1α蛋白表達(dá)

    胰腺癌組織中HIF-1α蛋白主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核,以胞質(zhì)著色為主(圖2A),非腫瘤性胰腺組織均無HIF-1α表達(dá)。88例胰腺癌中有67例HIF-1α高表達(dá)(76.1%),而對照組胰腺組織中HIF-1α表達(dá)陰性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.910,P<0.001)。HIF-1α高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01,表1)。

    圖1 組織芯片圖Fig.1 Tissue microarray

    2.2.2 HSP90蛋白表達(dá)

    胰腺癌組織中HSP90蛋白主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核,以胞核著色為主(圖2B)。本組患者HSP90蛋白在胰腺癌中高表達(dá)率為73.9%,在非腫瘤性胰腺組織中高表達(dá)率為18.2%,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.858,P<0.001)。HSP90高表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01);而與腫瘤大小、部位、病理分級無關(guān)(P>0.05,表1)。

    2.2.3 HIF-1α、HSP90在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

    Spearman秩相關(guān)分析顯示,在胰腺癌中,HIF-1α與HSP90表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01,表2)。

    表1 HIF-1α和HSP90的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between HIF-1α and HSP90 expression and clinical pathological characteristics of pancreatic carcinoma patients[n(%)]

    圖2 HIF-1α和HSP90在胰腺癌中陽性表達(dá)Fig.2 Positive expression of HIF-1α and HSP90 in pancreatic carcinoma

    表2 胰腺癌中HIF-1α、HSP90的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of HIF-1α and HSP90 in the pancreatic carcinoma

    2.3 HIF-1α、HSP90表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系

    對53例獲得隨訪結(jié)果的胰腺癌患者進行Kaplan-Meier生存分析,結(jié)果顯示HIF-1α低表達(dá)組患者的總生存率明顯高于各自高表達(dá)組,用log-rank檢驗進行組間生存率檢驗結(jié)果顯示,HIF-1α組間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.098,P<0.001),即HIF-1α高表達(dá)與胰腺癌預(yù)后不良有關(guān),而HSP90的高表達(dá)組與低表達(dá)組在Kaplan-Meier曲線中有相交點,log-rank檢驗組間生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.068,P=0.08,圖3、4)。

    經(jīng)Cox比例風(fēng)險回歸模型分析,單因素分析顯示,HIF-1α表達(dá)可作為評估胰腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)(表3)。

    圖3 HIF-1α表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.3 Relationship of HIF-1α expression and life span

    圖4 HSP90表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.4 Relationship of HSP90 expression and life span

    表3 胰腺癌單因素生存(COX比例風(fēng)險模型分析)結(jié)果Tab.3 Univariate survival result of pancreatic carcinoma (Cox rate risk model analysis)

    3 討 論

    缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一,同時腫瘤細(xì)胞的缺氧也是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動因子。HIF-1α是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一,也是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性作用的轉(zhuǎn)錄因子。

    HIF-1α在胰腺癌中存在高表達(dá)。Kitada等[4]用免疫組織化學(xué)的方法對胰腺癌組織進行HIF-1α檢測,結(jié)果是29例(59.2%)呈過表達(dá),淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移的有19例(76.0%)呈過表達(dá),而在非腫瘤的胰腺組織中表達(dá)呈陰性,HIF-1α與胰腺癌的腫瘤大小及TNM分期顯著相關(guān)。Akakura等[5]也證實20株胰腺癌細(xì)胞有15株表達(dá)HIF-1α蛋白,而且HIF-1α表達(dá)與胰腺癌的擴增和生存有關(guān)。本研究結(jié)果與上述文獻報道基本一致:88例胰腺癌中67例HIF-1α呈高表達(dá),而11例正常胰腺組織中無表達(dá),其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HIF-1α高表達(dá)率與胰腺癌的大小相關(guān)(P<0.01),即表明大多數(shù)胰腺癌組織存在著缺氧,在體積大的腫瘤組織中HIF-1α高表達(dá)率高,考慮是與體積大的腫瘤組織生長過快,內(nèi)部缺氧發(fā)生早,且程度重有關(guān);研究還表明,HIF-1α高表達(dá)率與胰腺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01),表明HIF-1α蛋白的表達(dá)預(yù)示胰腺癌有較高的惡性度和侵襲性。

    關(guān)于HIF-1α與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系報道中,Shibaji等[6]研究顯示,HIF-1α表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后呈正相關(guān),其高表達(dá)的患者預(yù)后較差。Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α高表達(dá)患者的總生存率低,Cox回歸分析顯示,HIF-1α是胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)。本研究隨訪分析結(jié)果顯示,HIF-1α高表達(dá)者預(yù)后較差,HIF-1α高表達(dá)與低表達(dá)生存曲線差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),經(jīng)單因素、多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示,HIF-1α表達(dá)具有獨立預(yù)后意義(P<0.05),即HIF-1α高表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后有關(guān),本組實驗結(jié)果與文獻報道相一致,由此可見,快速生長的胰腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生過量的HIF-1α,激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,提高能量代謝及血管形成體系,使之適應(yīng)這一缺氧環(huán)境而繼續(xù)增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。因此,HIF-1α的表達(dá)可反映胰腺癌的生物學(xué)行為,可以作為判斷胰腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有價值指標(biāo)。

    至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSP90在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)。Ogata等[8]報道胰腺癌中HSP90a呈選擇性高表達(dá),且與腫瘤的致癌作用有關(guān)。Kim等[9]研究結(jié)果表明,HSP90抑制劑選擇性阻止了胰腺癌細(xì)胞的生長和擴增,可見HSP90與胰腺癌有著密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示:HSP90在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胰腺組織(P<0.01),這一結(jié)果與各文獻中報道的HSP90在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)的結(jié)論一致。HSP90在正常胰腺組織中的表達(dá),認(rèn)為其作為分子伴侶參與調(diào)節(jié)正常胰腺腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞的生長和增殖;而在胰腺癌中的過表達(dá),可能與胰腺癌細(xì)胞的惡性增殖相關(guān),需要大量的HSP90調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程有關(guān)。

    目前對于HSP90與腫瘤病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系報道不一。Pick等[10]研究認(rèn)為,HSP90與乳腺癌的病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),是乳腺癌獨立的預(yù)后指標(biāo)。而Kurahashi等[11]對172例前列腺標(biāo)本進行免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)HSP90與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小無關(guān)。本研究結(jié)果顯示:胰腺癌中臨床分期越晚的HSP90表達(dá)越高,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HSP90表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示HSP90與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果還顯示:HSP90與胰腺癌的病理分級無關(guān),可能與HSP90表達(dá)存在著組織差異性有關(guān);HSP90的表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后無關(guān),可能與HSP90作為分子伴侶的功能有關(guān),其機制有待進一步論證。

    有關(guān)HIF-1α和HSP90的關(guān)系報道不多,Minet等[12]研究認(rèn)為在缺氧條件下,HSP90與HIF-1α的bHLH-PAS 結(jié)構(gòu)域結(jié)合來激活HIF-1α,而且HSP90的活性對于HIF-1α的激活作用是必須的。Lang等[13]研究結(jié)果表明,HSP90抑制劑17-AAG阻止了胰腺癌IL-6/STAT3/HIF-1α自分泌環(huán),抑制了腫瘤的生長。Jennifer等[14]使用VHL功能缺失的腎癌細(xì)胞株RCC進行實驗,發(fā)現(xiàn)了HSP90抑制劑的功能:⑴通過氧非依賴E3泛素連接酶促進了HIF-1α降解。⑵減少了HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。由此可以推斷,HSP90與HIF-1α的降解和轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,HIF-1α和HSP90聯(lián)合表達(dá)與胰腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

    隨著研究的不斷深入,目前已將HIF-1α、HSP90作為治療各類腫瘤的靶點,如HIF-1α516、格爾德霉素(geldanamycin,GA)等已進入臨床試驗,本研究結(jié)果為研發(fā)藥物來干預(yù)和治療胰腺癌提供了理論依據(jù)。

    [1] 劉峰, 干文娟, 馮一中. HSP90在胰腺癌組織芯片中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國血液流變學(xué)雜志, 2009, 19(1): 125-127.

    [2] 朱明華.組織微陣列及其在腫瘤病理研究中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志, 2002, 31: 72-74.

    [3] GUSTAVO A, TIMOTHY T, GUANG Y, et al. High levels of phosphorylated form of Akt-1 in prostate cancer and nonneoplastic prostate tissues are strong predictors of biochemical recurrence[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6572-6578.

    [4] KITADA T, SEKI S, SAKAGUCHI H, et al.Clinicopathological significance of hypoxia-inducible factor-1alpha expression in human pancreatic carcinoma[J].Histopathology, 2003, 43(6): 550-555.

    [5] AKAKURA N, KOBAVASHI M, HORIUCHI I, et al.Constitutive expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha renders pancreatic cancer cells resistant to apoptosis induced by hypoxia and nutrient deprivation[J]. Cancer Res, 2001,61(17): 6548-6554.

    [6] SHIBAJI T, NAGAO M, IKEDA N, et al. Prognostic significance of HIF-1 alpha overexpression in human pancreatic[J]. Anticancer Res, 2003, 23(6C): 4721-4727.

    [7] SUN H C, QIU Z J, LIU J, et al. Expression of hypoxiainducible factor-1 alpha and associated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma and their impact on prognosis[J].Int J Oncol, 2007, 30(6): 1359-1367.

    [8] OGATA M, NAITO Z, TANAKA S, et al. Overexpression and localization of heat shock proteins mRNA in pancreatic carcinoma[J]. J Nippon Med Sch, 2000, 67(3): 177-185.

    [9] KIM H L, CASSONE M, JR L O, et al. HIF-1α and STAT3 client proteins interacting with the cancer chaperone Hsp90[J]. Cancer Biol Ther, 2008, 7(1): 1-5.

    [10] PICK E, KLUGER Y, GILTNANE J M, et al. High HSP90 expression is associated with decreased survival in breast cancer[J]. Cancer Res, 2007, 67(7): 2932-2937.

    [11] KURAHASHI T, MIYAKE H, HARA I, et al. Expression of major heat shock proteins in prostate cancer: correlation with clinicopathological outcomes in patients undergoing radical prostatectomy[J]. J Urol, 2007, 177(2): 757-761.

    [12] MINET E, MOTTET D, MICHEL G, et al. Hypoxia-induced activation of HIF-1: role of HIF-1αlpha-Hsp90 interaction[J]. FEBS Lett, 1999, 460(2): 251-256.

    [13] LANG S A, MOSER C, GAUMANN A, et al. Targeting heat shock protein 90 in pancreatic cancer impairs insulin-like growth factor-I receptor signaling, disrupts an interleukin-6/signal-transducer and activator of transcription 3/hypoxiainducible factor-1alpha autocrine loop, and reduces orthotopic tumor growth[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(21): 6459-6468.

    [14] JENNIFER S I, YUN-JIN J, EDWARD G M, et al. Hsp90 Regulations a von hippel lindau-independent hypoxiainducible factor-1-degradative pathway[J]. J Biol Chem,2002, 277(33): 29936-29944.

    猜你喜歡
    陽性細(xì)胞胰腺癌胰腺
    胰腺癌治療為什么這么難
    同時多層擴散成像對胰腺病變的診斷效能
    STAT1和MMP-2在胰腺癌中表達(dá)的意義
    大口黑鱸鰓黏液細(xì)胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的分布
    早診早治趕走胰腺癌
    上海工運(2015年11期)2015-08-21 07:27:00
    哪些胰腺“病變”不需要外科治療
    人胎腦額葉和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育性變化
    18例異位胰腺的診斷與治療分析
    中西醫(yī)結(jié)合護理晚期胰腺癌46例
    急性白血病免疫表型及陽性細(xì)胞比例分析
    无遮挡黄片免费观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产亚洲av高清不卡| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜福利欧美成人| 日本免费a在线| 性色avwww在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 国产久久久一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 国产一区二区三区视频了| 啦啦啦免费观看视频1| 麻豆国产97在线/欧美| www.www免费av| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99国产精品99久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品 国内视频| 精品无人区乱码1区二区| 中文字幕久久专区| 亚洲专区国产一区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 天天添夜夜摸| 亚洲成a人片在线一区二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 白带黄色成豆腐渣| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 免费看美女性在线毛片视频| 中国美女看黄片| 又大又爽又粗| 两个人看的免费小视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成年人精品一区二区| 日韩av在线大香蕉| 99热这里只有精品一区 | 午夜两性在线视频| 久久99热这里只有精品18| 99国产综合亚洲精品| 麻豆国产av国片精品| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲美女黄片视频| 两个人视频免费观看高清| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品亚洲美女久久久| 一区二区三区高清视频在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线观看午夜福利视频| 观看免费一级毛片| 成年女人看的毛片在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 麻豆国产av国片精品| 欧美大码av| 国产毛片a区久久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www.www免费av| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产乱人伦免费视频| 91av网一区二区| 午夜福利免费观看在线| 国产成人av教育| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 十八禁网站免费在线| 日韩高清综合在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品国产清高在天天线| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 午夜a级毛片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 手机成人av网站| 一区福利在线观看| 两性夫妻黄色片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| av天堂中文字幕网| 色综合亚洲欧美另类图片| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩精品网址| 他把我摸到了高潮在线观看| 香蕉国产在线看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜两性在线视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 一本综合久久免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 青草久久国产| 国产激情偷乱视频一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费看光身美女| 国产精品久久久av美女十八| 欧美激情在线99| 欧美中文综合在线视频| 久久香蕉精品热| 欧美黑人欧美精品刺激| 在线看三级毛片| 亚洲av片天天在线观看| 91av网一区二区| 亚洲精华国产精华精| 午夜久久久久精精品| 在线观看66精品国产| 免费电影在线观看免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜日韩欧美国产| avwww免费| 这个男人来自地球电影免费观看| 日日夜夜操网爽| av中文乱码字幕在线| 我要搜黄色片| 国产精品永久免费网站| 1000部很黄的大片| 制服丝袜大香蕉在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 激情在线观看视频在线高清| 99热只有精品国产| 亚洲人成电影免费在线| 成人18禁在线播放| 成人精品一区二区免费| 12—13女人毛片做爰片一| 女警被强在线播放| 中出人妻视频一区二区| 欧美日本视频| 两个人的视频大全免费| 草草在线视频免费看| 免费看美女性在线毛片视频| bbb黄色大片| 国产精品一区二区免费欧美| 国产毛片a区久久久久| 午夜影院日韩av| 亚洲无线在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品久久久久久成人av| 久久久精品大字幕| 日本熟妇午夜| 亚洲美女黄片视频| 黄片大片在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜两性在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 黄频高清免费视频| 三级毛片av免费| 免费观看精品视频网站| 国产99白浆流出| 亚洲国产看品久久| 免费观看人在逋| 久久久国产精品麻豆| cao死你这个sao货| 无人区码免费观看不卡| 午夜久久久久精精品| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲精品粉嫩美女一区| or卡值多少钱| 一夜夜www| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久人人人人人| 色播亚洲综合网| 男女那种视频在线观看| 在线视频色国产色| 好男人在线观看高清免费视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 99re在线观看精品视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品一及| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日本熟妇午夜| www.999成人在线观看| 国产日本99.免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 我的老师免费观看完整版| 国产精品av久久久久免费| 午夜成年电影在线免费观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 制服丝袜大香蕉在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 嫩草影视91久久| 成人午夜高清在线视频| 亚洲av成人一区二区三| 在线永久观看黄色视频| 桃色一区二区三区在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| а√天堂www在线а√下载| 观看免费一级毛片| 丁香欧美五月| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 视频区欧美日本亚洲| 日本在线视频免费播放| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品 国内视频| 成人性生交大片免费视频hd| 免费观看精品视频网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 一二三四在线观看免费中文在| 久久香蕉国产精品| 欧美中文综合在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 女警被强在线播放| 身体一侧抽搐| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品电影一区二区三区| 久久久成人免费电影| 国产美女午夜福利| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品永久免费网站| www日本黄色视频网| 欧美色视频一区免费| 曰老女人黄片| av在线天堂中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜两性在线视频| 日本 欧美在线| 波多野结衣巨乳人妻| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲avbb在线观看| av中文乱码字幕在线| 十八禁人妻一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 级片在线观看| 99re在线观看精品视频| 国产97色在线日韩免费| 18禁观看日本| 精品一区二区三区视频在线 | 热99在线观看视频| 99久久综合精品五月天人人| 99国产极品粉嫩在线观看| 毛片女人毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品女同一区二区软件 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产高清三级在线| avwww免费| 国产视频内射| 两个人的视频大全免费| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成av人片在线播放无| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久国产精品人妻蜜桃| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久草成人影院| 成人国产一区最新在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国语自产精品视频在线第100页| 国产亚洲欧美在线一区二区| 午夜久久久久精精品| 啦啦啦免费观看视频1| 精品一区二区三区四区五区乱码| 悠悠久久av| 日本 欧美在线| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久精品欧美日韩精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲成a人片在线一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲性夜色夜夜综合| xxx96com| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 国产真实乱freesex| 99视频精品全部免费 在线 | 此物有八面人人有两片| 久9热在线精品视频| av天堂中文字幕网| 夜夜爽天天搞| 国产精品一区二区精品视频观看| 夜夜爽天天搞| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av第一区精品v没综合| 真人做人爱边吃奶动态| 国产黄a三级三级三级人| 国产毛片a区久久久久| 九九热线精品视视频播放| 国产探花在线观看一区二区| 黄片小视频在线播放| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲成a人片在线一区二区| 999久久久国产精品视频| 十八禁人妻一区二区| 国产黄片美女视频| 日韩av在线大香蕉| 精品福利观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 中文在线观看免费www的网站| 99re在线观看精品视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品午夜福利视频在线观看一区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产精品永久免费网站| 亚洲激情在线av| 久久伊人香网站| www日本黄色视频网| 女人被狂操c到高潮| 免费看a级黄色片| 免费在线观看成人毛片| 日本与韩国留学比较| 黄色片一级片一级黄色片| 老汉色∧v一级毛片| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲精品在线美女| 成年人黄色毛片网站| 久久精品91蜜桃| 中国美女看黄片| 亚洲专区国产一区二区| 午夜免费激情av| 国产视频一区二区在线看| 免费看十八禁软件| 亚洲电影在线观看av| 国产成人影院久久av| 国产精品1区2区在线观看.| 老鸭窝网址在线观看| 岛国在线观看网站| 日韩av在线大香蕉| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 69av精品久久久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品av久久久久免费| 欧美日本视频| 免费大片18禁| 国产精品99久久久久久久久| 国产黄色小视频在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 叶爱在线成人免费视频播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 岛国在线观看网站| 18美女黄网站色大片免费观看| av天堂中文字幕网| 国产亚洲精品久久久com| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日韩乱码在线| 国产1区2区3区精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久九九精品影院| 两个人看的免费小视频| 亚洲精品在线观看二区| a在线观看视频网站| 在线观看舔阴道视频| 国产成年人精品一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 国产激情欧美一区二区| avwww免费| aaaaa片日本免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产高清激情床上av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久精品热视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产高清视频在线观看网站| 成人精品一区二区免费| 制服丝袜大香蕉在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲九九香蕉| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品国产亚洲在线| 亚洲人与动物交配视频| 无遮挡黄片免费观看| 老司机福利观看| 草草在线视频免费看| 制服人妻中文乱码| 久久精品影院6| 少妇的逼水好多| 亚洲av电影在线进入| 91九色精品人成在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 在线观看66精品国产| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜视频精品福利| 最新在线观看一区二区三区| www日本黄色视频网| 欧美国产日韩亚洲一区| 十八禁网站免费在线| 少妇的逼水好多| 我要搜黄色片| 黄色成人免费大全| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜福利在线在线| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 91老司机精品| 久久久精品欧美日韩精品| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一二三四社区在线视频社区8| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 熟女人妻精品中文字幕| 色在线成人网| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 99在线视频只有这里精品首页| 男女做爰动态图高潮gif福利片| www.精华液| 午夜免费观看网址| 成人一区二区视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| a级毛片在线看网站| 亚洲中文字幕日韩| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品一区av在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品乱码久久久久久99久播| 99精品在免费线老司机午夜| a级毛片a级免费在线| 亚洲专区字幕在线| 亚洲国产精品成人综合色| 久久精品91蜜桃| 热99re8久久精品国产| 一级a爱片免费观看的视频| 日韩欧美在线二视频| 在线免费观看的www视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本成人三级电影网站| 欧美日韩一级在线毛片| 日本五十路高清| 成人亚洲精品av一区二区| 黄片小视频在线播放| 中文字幕高清在线视频| 午夜亚洲福利在线播放| 精品不卡国产一区二区三区| 一级作爱视频免费观看| 日韩欧美精品v在线| 亚洲第一电影网av| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲专区字幕在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费在线观看影片大全网站| 国产69精品久久久久777片 | 99国产精品99久久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一区二区三区激情视频| 国内精品久久久久久久电影| www日本黄色视频网| 精品国产乱码久久久久久男人| 白带黄色成豆腐渣| 最近在线观看免费完整版| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲精品色激情综合| 欧美日本视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色 视频免费看| 国产成人欧美在线观看| 久久久成人免费电影| 看片在线看免费视频| 成人午夜高清在线视频| 一二三四在线观看免费中文在| 在线观看日韩欧美| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 午夜久久久久精精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲色图av天堂| 在线观看日韩欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲九九香蕉| 熟女电影av网| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久亚洲精品不卡| 一级毛片精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 999久久久精品免费观看国产| 国产69精品久久久久777片 | 91在线观看av| 免费看十八禁软件| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 成年女人永久免费观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 在线观看日韩欧美| 男人舔女人下体高潮全视频| 日日夜夜操网爽| 欧美激情在线99| 12—13女人毛片做爰片一| 特大巨黑吊av在线直播| 免费高清视频大片| 国产免费男女视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 波多野结衣高清无吗| 黄色丝袜av网址大全| or卡值多少钱| 国产精品亚洲一级av第二区| 99热6这里只有精品| 丰满的人妻完整版| 少妇的逼水好多| 久久精品91无色码中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产av一区在线观看免费| 中文字幕熟女人妻在线| 国产亚洲av高清不卡| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 国产亚洲精品一区二区www| 这个男人来自地球电影免费观看| 最好的美女福利视频网| 中文在线观看免费www的网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 动漫黄色视频在线观看| 精品久久蜜臀av无| 波多野结衣高清作品| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 最近在线观看免费完整版| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产1区2区3区精品| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 久久热在线av| 51午夜福利影视在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 婷婷丁香在线五月| 国产亚洲欧美在线一区二区| 在线观看66精品国产| 两人在一起打扑克的视频| 深夜精品福利| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 女人被狂操c到高潮| 波多野结衣高清作品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产亚洲欧美98| 国产一区二区在线观看日韩 | 午夜精品久久久久久毛片777| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 精品福利观看| 午夜免费激情av| 999久久久国产精品视频| 又爽又黄无遮挡网站| 一区福利在线观看| 男女那种视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 搞女人的毛片| 男女视频在线观看网站免费| 动漫黄色视频在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产一区在线观看成人免费| 成人18禁在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 色综合婷婷激情| 欧美zozozo另类| 久久精品91蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 国产一区二区在线观看日韩 | 中出人妻视频一区二区| 午夜免费观看网址| 中文字幕高清在线视频| cao死你这个sao货| av中文乱码字幕在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 日本 欧美在线| 精品久久久久久,| 免费一级毛片在线播放高清视频| 性色avwww在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 日韩欧美在线乱码| 黄片大片在线免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久午夜亚洲精品久久|