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    HIF-1α、HSP90在胰腺癌組織芯片中的表達(dá)及其臨床意義

    2011-08-14 05:17:36干文娟馮一中李峰
    中國癌癥雜志 2011年8期
    關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞胰腺癌胰腺

    干文娟 馮一中 李峰

    1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,江蘇 蘇州 215006;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系,江蘇 蘇州 215123;3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科,江蘇 蘇州 215004

    缺氧是實體腫瘤生長過程中普遍存在的一種現(xiàn)象,腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性與缺氧有關(guān),介導(dǎo)缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者是缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1),HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成。其中HIF-1a是HIF-1的活性亞基,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展和預(yù)后預(yù)測中具有重要意義,目前對于HIF-1α在胰腺癌中表達(dá)情況的研究國內(nèi)外還鮮見報道。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是生物體中普遍存在的高度保守的蛋白質(zhì),其主要的生物學(xué)功能是在應(yīng)激狀態(tài)下與靶蛋白形成復(fù)合體,以調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能,但又不參與靶蛋白的組成。因此,HSP又被稱為“分子伴侶”或“伴侶蛋白”。HSP90是分子伴侶中一組較為獨特的蛋白質(zhì),除了作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、運輸和合成過程以外,還能和一系列參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的激酶分子和突變蛋白質(zhì)相結(jié)合,并調(diào)節(jié)它們的穩(wěn)定性,從而影響多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

    HSP90在胰腺癌中的過表達(dá)可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[1]。本研究利用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化方法檢測胰腺癌組織中HIF-1α、HSP90蛋白的表達(dá)及其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,探討HIF-1α、HSP90在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及對預(yù)后的影響。

    1 資料和方法

    1.1 臨床資料

    收集本校附屬醫(yī)院及部分外院1993年—2007年胰腺癌手術(shù)標(biāo)本和臨床資料齊備者88例,所有患者均未給予術(shù)前放療、化療,且腫瘤組織均制備組織切片并行HE染色,并由2名病理醫(yī)師采用雙盲法確診為胰腺導(dǎo)管腺癌,其中位于胰頭者64例,胰體尾部者24例;男性59例,女性29例,年齡39~80歲,中位年齡62.50歲;腫瘤直徑≤4 cm者45例,>4 cm者43例;按照1997年國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進:Ⅰ期29例,Ⅱ期11例,Ⅲ期27例,Ⅳ期21例。組織學(xué)分級為:高分化腺癌17例,中分化腺癌50例,低分化腺癌21例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例。88例患者中有53例獲得隨訪資料,隨訪時間為2個月~6年,平均隨訪時間為(13.32±10.35)個月。其中死亡數(shù)為48例,生存(截尾數(shù)據(jù)) 數(shù)為5例。另外選取11例同時期非腫瘤性胰腺組織手術(shù)標(biāo)本作為對照。

    1.2 方法

    1.2.1 組織芯片的制作

    標(biāo)本均為4%甲醛溶液固定,常規(guī)組織處理、石蠟包埋。采用手工制作組織芯片,所用組織芯片制作儀為Instrumendics公司產(chǎn)品,取樣針直徑1.5 mm,組織芯間距1.0 mm。組織芯片制作步驟見文獻[2]。

    1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測

    對HIF-1α、HSP90分別采用SABC法、EnVision染色法,染色步驟按產(chǎn)品說明書進行,DAB顯色,一抗HIF-1α多克隆抗體(BA-0912)及二抗生物素化羊抗兔IgG抗體均購自Santa Cruz公司,HIF-1α抗體的工作濃度為1∶50,羊抗兔IgG抗體為即用型抗體。HSP90α/β(N-17)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,工作濃度為1∶100,即用型EnVision試劑(HRP/Rabbit)購于丹麥Dako公司。用PBS代替一抗作為陰性對照,用已知陽性的胰腺癌切片作為陽性對照。

    1.2.3 免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果判定

    用雙盲法由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師分別對免疫組化染色結(jié)果進行評估。鏡檢顯示胞質(zhì)或胞核染為淡黃色至棕黃色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。HIF-1α蛋白的陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì),少數(shù)定位于細(xì)胞核,HSP90在細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核均有表達(dá),以胞核表達(dá)為主。在高倍鏡(×400)下對每張切片隨機選擇5個視野,每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,共計1 000個。參照Gustavo等[3]的方法,綜合染色強度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進行半定量處理;根據(jù)染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)為:沒有染色為0分;弱染色但強于陰性對照為1分;中度染色為2分;強染色為3分;根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的評分標(biāo)準(zhǔn)為:無陽性細(xì)胞數(shù)為0分;不足34%陽性細(xì)胞數(shù)為1分;34%~66%陽性細(xì)胞數(shù)為2分;>66%陽性細(xì)胞數(shù)為3分。上述評分結(jié)果兩項相乘,0~6分為低表達(dá),>6分為高表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    統(tǒng)計軟件使用SPSS 13.0軟件包。HIF-1α、HSP90蛋白在非腫瘤性胰腺組織及胰腺癌各臨床參數(shù)之間表達(dá)差異的比較采用四格表資料的χ2檢驗。用Spearman秩相關(guān)進行HIF-1α、HSP90蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。對有隨訪資料的HIF-1α、HSP90的表達(dá)作出Kaplan-Meier生存曲線,各組間生存率用log-rank檢驗進行組間生存率的比較,HIF-1α、HSP90的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系采用單因素Cox回歸模型進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 組織芯片

    成功制備胰腺癌組織芯片蠟塊1個,為11×9點組織列陣,含99個位點,無組織芯脫落(圖1A)。組織芯片切片HE染色顯示所有位點組織結(jié)構(gòu)保存良好,無明顯壞死組織,組織芯片排列整齊(圖1B)。

    2.2 HIF-1α與HSP90蛋白表達(dá)

    2.2.1 HIF-1α蛋白表達(dá)

    胰腺癌組織中HIF-1α蛋白主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核,以胞質(zhì)著色為主(圖2A),非腫瘤性胰腺組織均無HIF-1α表達(dá)。88例胰腺癌中有67例HIF-1α高表達(dá)(76.1%),而對照組胰腺組織中HIF-1α表達(dá)陰性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.910,P<0.001)。HIF-1α高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01,表1)。

    圖1 組織芯片圖Fig.1 Tissue microarray

    2.2.2 HSP90蛋白表達(dá)

    胰腺癌組織中HSP90蛋白主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核,以胞核著色為主(圖2B)。本組患者HSP90蛋白在胰腺癌中高表達(dá)率為73.9%,在非腫瘤性胰腺組織中高表達(dá)率為18.2%,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.858,P<0.001)。HSP90高表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01);而與腫瘤大小、部位、病理分級無關(guān)(P>0.05,表1)。

    2.2.3 HIF-1α、HSP90在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

    Spearman秩相關(guān)分析顯示,在胰腺癌中,HIF-1α與HSP90表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01,表2)。

    表1 HIF-1α和HSP90的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between HIF-1α and HSP90 expression and clinical pathological characteristics of pancreatic carcinoma patients[n(%)]

    圖2 HIF-1α和HSP90在胰腺癌中陽性表達(dá)Fig.2 Positive expression of HIF-1α and HSP90 in pancreatic carcinoma

    表2 胰腺癌中HIF-1α、HSP90的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of HIF-1α and HSP90 in the pancreatic carcinoma

    2.3 HIF-1α、HSP90表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系

    對53例獲得隨訪結(jié)果的胰腺癌患者進行Kaplan-Meier生存分析,結(jié)果顯示HIF-1α低表達(dá)組患者的總生存率明顯高于各自高表達(dá)組,用log-rank檢驗進行組間生存率檢驗結(jié)果顯示,HIF-1α組間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.098,P<0.001),即HIF-1α高表達(dá)與胰腺癌預(yù)后不良有關(guān),而HSP90的高表達(dá)組與低表達(dá)組在Kaplan-Meier曲線中有相交點,log-rank檢驗組間生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.068,P=0.08,圖3、4)。

    經(jīng)Cox比例風(fēng)險回歸模型分析,單因素分析顯示,HIF-1α表達(dá)可作為評估胰腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)(表3)。

    圖3 HIF-1α表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.3 Relationship of HIF-1α expression and life span

    圖4 HSP90表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.4 Relationship of HSP90 expression and life span

    表3 胰腺癌單因素生存(COX比例風(fēng)險模型分析)結(jié)果Tab.3 Univariate survival result of pancreatic carcinoma (Cox rate risk model analysis)

    3 討 論

    缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一,同時腫瘤細(xì)胞的缺氧也是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動因子。HIF-1α是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一,也是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性作用的轉(zhuǎn)錄因子。

    HIF-1α在胰腺癌中存在高表達(dá)。Kitada等[4]用免疫組織化學(xué)的方法對胰腺癌組織進行HIF-1α檢測,結(jié)果是29例(59.2%)呈過表達(dá),淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移的有19例(76.0%)呈過表達(dá),而在非腫瘤的胰腺組織中表達(dá)呈陰性,HIF-1α與胰腺癌的腫瘤大小及TNM分期顯著相關(guān)。Akakura等[5]也證實20株胰腺癌細(xì)胞有15株表達(dá)HIF-1α蛋白,而且HIF-1α表達(dá)與胰腺癌的擴增和生存有關(guān)。本研究結(jié)果與上述文獻報道基本一致:88例胰腺癌中67例HIF-1α呈高表達(dá),而11例正常胰腺組織中無表達(dá),其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HIF-1α高表達(dá)率與胰腺癌的大小相關(guān)(P<0.01),即表明大多數(shù)胰腺癌組織存在著缺氧,在體積大的腫瘤組織中HIF-1α高表達(dá)率高,考慮是與體積大的腫瘤組織生長過快,內(nèi)部缺氧發(fā)生早,且程度重有關(guān);研究還表明,HIF-1α高表達(dá)率與胰腺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01),表明HIF-1α蛋白的表達(dá)預(yù)示胰腺癌有較高的惡性度和侵襲性。

    關(guān)于HIF-1α與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系報道中,Shibaji等[6]研究顯示,HIF-1α表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后呈正相關(guān),其高表達(dá)的患者預(yù)后較差。Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α高表達(dá)患者的總生存率低,Cox回歸分析顯示,HIF-1α是胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)。本研究隨訪分析結(jié)果顯示,HIF-1α高表達(dá)者預(yù)后較差,HIF-1α高表達(dá)與低表達(dá)生存曲線差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),經(jīng)單因素、多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示,HIF-1α表達(dá)具有獨立預(yù)后意義(P<0.05),即HIF-1α高表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后有關(guān),本組實驗結(jié)果與文獻報道相一致,由此可見,快速生長的胰腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生過量的HIF-1α,激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,提高能量代謝及血管形成體系,使之適應(yīng)這一缺氧環(huán)境而繼續(xù)增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。因此,HIF-1α的表達(dá)可反映胰腺癌的生物學(xué)行為,可以作為判斷胰腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有價值指標(biāo)。

    至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSP90在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)。Ogata等[8]報道胰腺癌中HSP90a呈選擇性高表達(dá),且與腫瘤的致癌作用有關(guān)。Kim等[9]研究結(jié)果表明,HSP90抑制劑選擇性阻止了胰腺癌細(xì)胞的生長和擴增,可見HSP90與胰腺癌有著密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示:HSP90在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胰腺組織(P<0.01),這一結(jié)果與各文獻中報道的HSP90在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)的結(jié)論一致。HSP90在正常胰腺組織中的表達(dá),認(rèn)為其作為分子伴侶參與調(diào)節(jié)正常胰腺腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞的生長和增殖;而在胰腺癌中的過表達(dá),可能與胰腺癌細(xì)胞的惡性增殖相關(guān),需要大量的HSP90調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程有關(guān)。

    目前對于HSP90與腫瘤病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系報道不一。Pick等[10]研究認(rèn)為,HSP90與乳腺癌的病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),是乳腺癌獨立的預(yù)后指標(biāo)。而Kurahashi等[11]對172例前列腺標(biāo)本進行免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)HSP90與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小無關(guān)。本研究結(jié)果顯示:胰腺癌中臨床分期越晚的HSP90表達(dá)越高,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HSP90表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示HSP90與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果還顯示:HSP90與胰腺癌的病理分級無關(guān),可能與HSP90表達(dá)存在著組織差異性有關(guān);HSP90的表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后無關(guān),可能與HSP90作為分子伴侶的功能有關(guān),其機制有待進一步論證。

    有關(guān)HIF-1α和HSP90的關(guān)系報道不多,Minet等[12]研究認(rèn)為在缺氧條件下,HSP90與HIF-1α的bHLH-PAS 結(jié)構(gòu)域結(jié)合來激活HIF-1α,而且HSP90的活性對于HIF-1α的激活作用是必須的。Lang等[13]研究結(jié)果表明,HSP90抑制劑17-AAG阻止了胰腺癌IL-6/STAT3/HIF-1α自分泌環(huán),抑制了腫瘤的生長。Jennifer等[14]使用VHL功能缺失的腎癌細(xì)胞株RCC進行實驗,發(fā)現(xiàn)了HSP90抑制劑的功能:⑴通過氧非依賴E3泛素連接酶促進了HIF-1α降解。⑵減少了HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。由此可以推斷,HSP90與HIF-1α的降解和轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,HIF-1α和HSP90聯(lián)合表達(dá)與胰腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

    隨著研究的不斷深入,目前已將HIF-1α、HSP90作為治療各類腫瘤的靶點,如HIF-1α516、格爾德霉素(geldanamycin,GA)等已進入臨床試驗,本研究結(jié)果為研發(fā)藥物來干預(yù)和治療胰腺癌提供了理論依據(jù)。

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