α、β-微管蛋白在乳腺癌變不同階段的表達(dá)及意義

應(yīng)榮彪 馮俊 李建軍 瞿海江 姚俊

臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院臺(tái)州分院腫瘤外科，浙江 臺(tái)州 317502

微管是細(xì)胞骨架的主要組成部分, 由α、β-微管蛋白異二聚體組成［1］，是紫杉烷類抗腫瘤的作用靶點(diǎn)，微管蛋白可以通過對(duì)這一靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)影響紫杉醇的抗腫瘤活性。微管在細(xì)胞分裂中具有極其重要的作用, 現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)之一。目前，紫杉烷類是治療乳腺癌最重要的化療藥物之一，通過促進(jìn)微管蛋白聚合，最終導(dǎo)致乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡。然而紫杉烷類的耐藥性常常限制了治療效果，使病情難以長期控制。故揭示α、β-微管蛋白在乳腺癌變過程中表達(dá)水平的變化顯得尤為重要，為通過改變其表達(dá)水平改善乳腺癌紫杉烷類化療耐藥性提供理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院2004年8月—2009年12月間具有完整的臨床病理資料和存檔的石蠟包埋組織標(biāo)本，按世界衛(wèi)生組織(WHO)乳腺病理組織學(xué)分類(2003年新版)標(biāo)準(zhǔn)［2］，經(jīng)雙盲病理診斷，乳腺非典型增生(atypical ductal hyperplasia，ADH)30例，從同期病例中隨機(jī)抽樣，導(dǎo)管內(nèi)癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)30例和浸潤性癌(invasive ductal carcinoma，IDC)30例，另從乳腺纖維腺瘤行區(qū)段切除術(shù)的標(biāo)本中取瘤旁正常乳腺組織30例。

1.2 試劑與儀器

鼠抗人α-tubulin單克隆抗體IgG(ZM-0438)，鼠抗人β-tubulin單克隆抗體IgG(sc-58880)為Santa Cruz公司產(chǎn)品；超敏即用型鼠二步法(非生物素)免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(PV-9002)為美國GBI公司產(chǎn)品；使用全自動(dòng)免疫組化機(jī)(美國Biogenex AS60302)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)：按照免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行(一抗稀釋度：α-微管蛋白1∶100，β-微管蛋白1∶100)。以PBS液代替第一抗體做陰性對(duì)照，以已知乳腺癌切片做陽性對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

α、β-微管蛋白染色陽性定義為：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色。染色結(jié)果采用雙盲法閱片判斷，依據(jù)Tanaka的定量計(jì)分法［3］:選取5個(gè)有代表性的不同區(qū)域，400倍鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞百分率并評(píng)定顯色強(qiáng)度，依照陽性細(xì)胞百分率≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%和>75%分別得0、1、2、3、4分；依照顯色強(qiáng)度未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別得0、1、2、3分，兩項(xiàng)得分相乘，并取5個(gè)高倍視野得分的平均值。按照分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí)：0～1為(-)，2～4為(+)，5～8為(++)，9分以上為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測(cè)所得結(jié)果為等級(jí)資料，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以秩和檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析為統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 α、β-微管蛋白表達(dá)和定位

可于光鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈均勻著色的棕黃色顆粒，細(xì)胞核、間質(zhì)纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞等均無陽性著色(圖1，2)，各組樣本α、β-微管蛋白免疫組織化學(xué)染色評(píng)分情況(表1)，正常乳腺組陽性率最低，ADH組、DCIS組至IDC組陽性率逐漸上升，其中IDC組最高。

圖1 α-微管蛋白分別在正常組織(A)、ADH(B)、DCIS(C)及IDC(D)中的表達(dá)Fig.1 Expression of α-tubulin in normal(A), ADH(B), DCIS(C) and IDC(D) tissue of breast(PV, ×200)

圖2 β-微管蛋白分別在正常組織(A)、ADH(B)、DCIS(C)及IDC(D)中的表達(dá)Fig.2 Expression of β-tubulin in normal(A), ADH(B), DCIS(C) and IDC(D) tissue of breast(PV, ×200)

表1 α、β-微管蛋白在不同乳腺組織中的表達(dá)情況Tab.1 Expression of α, β-tubulin in different breast tissues

2.2 α、β-微管蛋白表達(dá)的組間相關(guān)性

α-微管蛋白在乳腺正常組織、ADH、DCIS及IDC病例中的表達(dá)經(jīng)等級(jí)分組資料的秩和檢驗(yàn)(Krauskal-Wallis檢驗(yàn))，上述4組樣本間表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.864，P=0.000)，再通過Mann-Whitney檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行兩兩比較：各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

β-微管蛋白在乳腺正常組織、ADH、DCIS及IDC病例中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.28，P=0.000)，各組進(jìn)行兩兩比較：除ADH組和DCIS組間、DCIS組和IDC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 不同乳腺組織間α、β-微管蛋白表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of α, β-tubulin expression in different breast tissues

2.3 α、β-微管蛋白表達(dá)的組內(nèi)相關(guān)性

分別在各組內(nèi)對(duì)α、β-微管蛋白的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在ADH、DCIS及IDC各組內(nèi)，α、β-微管蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，而正常乳腺組織則無相關(guān)性(表3)。

表3 α、β-微管蛋白在不同組織中表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 Correlation of α, β-tubulin expression in different breast tissues

3 討 論

紫杉烷類是乳腺癌最重要的化療藥物之一［4］，可通過促使α、β-微管蛋白異二聚體裝配成微管，并阻止其解聚而使微管束不能與微管組織中心相互連接，由此抑制紡錘體的正常形成，將細(xì)胞周期阻斷于G2/M期，導(dǎo)致有絲分裂異?；蛲Ｖ?，使癌細(xì)胞無法繼續(xù)分裂而死亡［5］。最近的研究表明，乳腺癌患者對(duì)紫杉烷類耐藥性的出現(xiàn)，至少部分是由乳腺腫瘤細(xì)胞中α、β-微管蛋白的表達(dá)或修飾水平發(fā)生改變所引起的。

α、β-微管蛋白表達(dá)異常與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。Giarnieri等［6］研究發(fā)現(xiàn)，α、β-微管蛋白的表達(dá)與直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)從α、β-微管蛋白在乳腺癌變不同階段表達(dá)水平的角度來探討其與乳腺癌的關(guān)系。結(jié)果顯示，在乳腺正常細(xì)胞、ADH、DCIS及IDC發(fā)展過程中，α、β-微管蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)逐漸上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示α、β-微管蛋白的異?？沙霈F(xiàn)在乳腺癌浸潤前的早期階段，并促進(jìn)了細(xì)胞惡變和癌變的進(jìn)展。

經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在ADH及DCIS中，α、β-微管蛋白標(biāo)志的陽性細(xì)胞數(shù)也明顯高于正常組織組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在ADH和DCIS中均已有α、β-微管蛋白的過度表達(dá)，可以推測(cè)在乳腺惡性腫瘤形成的關(guān)鍵性步驟中，隨著α、β-微管蛋白表達(dá)量逐漸增加，解聚動(dòng)力加快，與微管蛋白池交換蛋白數(shù)量增加，引起中心體拷貝數(shù)增加，多紡錘體形成。中心體異?？蓪?dǎo)致染色體組的不穩(wěn)定性和非整倍體的形成，導(dǎo)致抑癌基因的缺失或癌基因的獲得，改變細(xì)胞表型進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展［7-8］。

本研究通過檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的中心體α、β-微管蛋白的改變，闡述了乳腺癌發(fā)展的不同階段組織中α、β-微管蛋白表達(dá)水平的變化，并對(duì)乳腺癌的發(fā)展模式進(jìn)行了討論。這些研究成果從細(xì)胞遺傳學(xué)角度進(jìn)一步闡明乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，提示α、β-微管蛋白可以作為乳腺癌腫瘤標(biāo)志物，用于揭示乳腺癌發(fā)生、發(fā)展并作為治療指導(dǎo)。其次，在乳腺癌的治療過程中如果配合α、β-微管蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)，并輔以針對(duì)α、β-微管蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)的聯(lián)合治療，有可能提高乳腺癌對(duì)紫杉烷類的敏感性，改善預(yù)后。

［1］ LEWIS S A, TIAN G, COWAN N J. The alpha- and betatubulin folding pathways［J］.Trends Cell Biol, 1997, 7(12):479-484.

［2］ TAVASSOLI F A, DEVILEE P. The WHO classification of tumors of the breast and female genital organs［M］. Lyon:IARC Press, 2003: 110-112.

［3］ TANAKA K, IWAMOTO S, GON G, et al. Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas［J］. Clin Cancer Res, 2000, 6(1): 127-134.

［4］ MCGROGAN B T, GILMARTIN B, CARNEY D N, et al.Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer［J］.Biochim Biophys Acta, 2008, 1785(2): 96-132.

［5］ EL-KAREH A W, LABES R E, SECOMB T W. Cell cycle checkpoint models for cellular pharmacology of paclitaxel and platinum drugs［J］. AAPS J, 2008, 10(1): 15-34.

［6］ GIARNIERI E, DE FRANCESCO G P, CARICO E, et al. Alpha- and beta-tubulin expression in rectal cancer development［J］. Anticancer Res, 2005, 25(5): 3237-3241.

［7］ STORCHOVA Z, PELLMAN D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5(1): 45-54.

［8］ SALISBURY J L, D'ASSORO A B, LINGLE W L. Centrosome amplification and the origin of chromosomal instability in breast cancer［J］. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2004,9(3): 275-283.