充血性心力衰竭患者外周血中內(nèi)皮素受體基因的表達及意義

龔少愚,周春剛,高 楓,陸 曙,朱紅俊

(南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院/無錫市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇 無錫 214001)

近年來的研究表明,內(nèi)皮素(ET-1)是迄今發(fā)現(xiàn)的最強烈的收縮血管物質,內(nèi)皮素系統(tǒng)在心力衰竭(簡稱心衰)的發(fā)病過程中起著重要作用[1]。升高的血漿ET-1濃度不但和心衰時的癥狀和血流動力學的嚴重程度呈正相關[2],而且影響患者的預后,能引起心肌肥厚和心肌細胞損傷[3]。ET和ET受體的生物學意義及表達調控機制日益引起人們的重視。本院利用已構建的外周血ETA、ETB基因的逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測方法,對48例心衰患者和25例健康對照組的外周血中內(nèi)皮素受體基因(ETA、ETB)的表達進行了檢測,從而探討其臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 心衰患者48例,均為本院心內(nèi)科2009年2月至2010年2月的住院患者,男25例,女23例,年齡49～82歲,平均(72.2±8.3)歲;其中冠心病 28例,高血壓性心臟病15例,擴張型心肌病5例;均經(jīng)超聲心動圖證實為充血性心力衰竭,EF值小于50%。依據(jù)NYHA心功能分級,Ⅱ級13例,Ⅲ級18例,Ⅳ級17例。選擇25例健康體檢無心功能不全證據(jù)的成年人作為對照組,其中男 14例,女 11例,年齡 48～76歲,平均(68.2±7.6)歲,兩組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 ET-1的測定 兩組均于入院后第1天清晨采空腹靜脈血 2 mL(30 μ L EDTA 加 20 μ L 抑肽酶),立即離心,分離血清,-80℃冰箱保存,集中采用放射免疫方法測定,試劑盒由北京東亞免疫技術研究所提供。

1.2.2 全血總RNA抽提 清晨采空腹靜脈血3 mL,經(jīng)EDTA?Na2抗凝,采用3S柱離心式血液總 RNA抽提試劑盒(K3620上海博彩生物科技有限公司),RNA濃度測定采用BIO-RAD核酸蛋白測量儀(SmartSpec Plus Spectrophotometer),RNA提取物-80℃保存。

1.2.3 外周血 ETA、ETB基因表達的檢測方法 外周血ETA、ETB mRNA表達水平通過實時熒光定量PCR技術進行相對定量檢測。ETA受體基因引物序列,GenBank:NM-001957 正向 5′-GCT TCC TGG TTA CCA CTC ATC AA-3′,反向 5′-TAG TCT GCT GTG GGC AAT AGT TG-3′。 ETB受體基因引物序列,GenBank:NM-001101正向,5′-GCC AAG GAC CCA TCG AGA T-3′,反向 5′-GAA GTG TGG AGT TCC CGA TGA T-3′。管家基因 GAPDH作為內(nèi)參基因,GAPDH基因引物序列,GenBank:NM-002046.3,正向5′-ACA GTC AGC CGC A TC TTC TT-3′,反向 5′-ACG ACC AAA TCC GT T GAC TC-3′。

實時熒光定量PCR采用兩步法,全血總RNA合成cDNA使用TAKARA反轉錄反應試劑盒(DRR037S大連寶生物工程有限公司)。實時熒光定量 PCR采用SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ試劑盒(DRR083S大連寶生物工程有限公司),PCR儀采用LightCycler480擴增儀。實時熒光定量PCR反應體系為20 μ L,包括 2×SYBR Premix Ex Taq,1～ 100 ng cDNA,50 pmoL/μ L引物。兩步法 PCR循環(huán)條件:預變性95℃30 s一個循環(huán),變性 95℃5 s,退火/延伸60℃20 s,共40個循環(huán)。溶解曲線分析采用LightCycler Relative Quantification(Version 1.5)軟件,用于產(chǎn)物的特異性分析,2%瓊脂糖凝膠電泳亦用于擴增產(chǎn)物的大小及特異性鑒定。

表1 心衰患者和健康對照組血漿ET-1水平、ETA 、ETB基因表達的比較()

表1 心衰患者和健康對照組血漿ET-1水平、ETA 、ETB基因表達的比較()

*:P＞0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.05,與健康對照組比較。

組別 n ET-1(ng/L) ET A ET B健康對照組 25 67.34±14.36 1.08±0.32 1.00±0.28心功能Ⅱ級組 13 82.24±12.48* 1.09±0.25* 0.92±0.30*心功能Ⅲ級+Ⅳ級組 35 126.25±16.51** 2.06±0.49** 1.67±0.47***

相對定量分析采用△△CT法進行相對定量。△△CT法是通過LightCycler Relative Quantification(Version 1.5)軟件,假定目的基因和內(nèi)參基因擴增效率相同時,擴增效率默認為2,標準化比值計算公式為2-△△CT。

1.3 統(tǒng)計學處理 計數(shù)資料用χ2檢驗,計量資料以表示,組間均數(shù)比較用方差分析,同組治療前后均數(shù)用配對t檢驗。各檢測指標間進行相關性分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 擴增產(chǎn)物電泳及溶解曲線分析 ETA、ETB和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的RT-qPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結果顯示擴增產(chǎn)物均為單一條帶,無引物二聚體形成,大小分別為84、99、94 bp,見圖 1。擴增產(chǎn)物溶解曲線分析,產(chǎn)物具有單一明顯而尖峭的峰圖,說明產(chǎn)物特異無非特異性產(chǎn)物生成,見圖2。

圖1 目的基因和內(nèi)參基因2%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 目的基因和內(nèi)參基因溶解曲線峰圖

2.2 心衰患者和健康對照組血漿ET-1水平、ETA、ETB基因表達的比較 結果表明,心功能Ⅱ級組的血漿ET-1水平及ETA、ETB基因表達與健康對照組比較,兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。心功能Ⅲ級+Ⅳ級組的血漿ET-1水平與健康對照組比較,兩組差異具有統(tǒng)計學意義(F=8.014,P＜0.01)。心功能Ⅲ級+Ⅳ級組的ETA基因表達與健康對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(F=8.317,P＜0.01);心功能Ⅲ級+Ⅳ級組的ETB基因表達與健康對照組比較,兩組差異具有統(tǒng)計學意義(F=6.235,P＜0.05)。此外,不同病因引起的心力衰竭之間血漿ET-1水平、ETA 、ETB基因表達等無顯著性差異,可能與病例數(shù)較少有關,見表 1。

3 討 論

ET是由血管內(nèi)皮細胞分泌的一種血管收縮肽,缺氧、機械性應力、神經(jīng)內(nèi)分泌激素(如去甲腎上腺素、血管緊張素Ⅱ)、細胞因子(轉化生長因子-β和白介素 1β)等[4]可以刺激血管內(nèi)皮細胞釋放ET-1。大量試驗表明在心衰過程中ET-1的水平顯著升高,它們的升高與心搏出量的減少、肺動脈高壓、肺血管阻力的增高以及心臟的重構、肥厚和纖維化都有關[1-5]。心衰患者中,隨著心功能的惡化,內(nèi)皮依賴性舒張功能呈減退趨勢[6]。ET的生物學效應就是由內(nèi)皮特異受體介導的[7]。ET的受體有ETA和ETB兩種亞型[8]。ETA受體存在于血管平滑肌細胞和心肌細胞中,調節(jié)血管收縮和細胞增生[9]。ETB受體存在于內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞,通常調節(jié)血管舒張;但在某些病理情況下,亦可引起血管收縮[10-11]。心衰時ETB還參與心肌纖維化的進展和循環(huán)中ET-1的清除[12]。發(fā)生心衰時內(nèi)皮素受體介導的信號轉導系統(tǒng)被顯著激活,表現(xiàn)為ET受體的密度上調、ET-1結合位點增加、血漿ET-1水平隨著心衰程度的加重而進行性升高[13-14]。

在心衰患者中,肺循環(huán)是ET-1的主要來源和清除部位,故肺血管阻力與循環(huán)ET-1水平直接相關[11]。本文結果顯示,心衰患者血漿ET-1濃度明顯升高,與NYHA心功能分級呈正相關。Lepailleur-endouf等[15]也發(fā)現(xiàn),心衰患者失代償期血漿ET-1分別是代償期及對照組的4.2倍及6.9倍,本研究結果與其相似。本文結果還顯示,心衰患者血漿ET受體基因表達與NYHA心功能分級和血液動力學有很大關系,心功能Ⅲ～Ⅳ級組患者ETA、ETB的基因表達水平明顯高于心功能Ⅱ級組及健康對照組,即心功能愈差,ET受體基因表達升高愈顯著。本研究中可看出,心衰患者血漿ET升高,外周血單個核細胞ETA、ETB表達上調,說明ET系統(tǒng)在心衰的促發(fā)及惡化方面起一定的作用。

[1]Cowburn PJ,Cleland JGF.Endothelin antagonists for chronic heant failure:dother have a role[J].Eurheart J,2001,22(19):1772-1784.

[2]Kiowski W,Sutsch G,Oechslin E,et al.Hem odynam ic efiects of bosentam in patients with chron icheart faihiue[J].Heart Fail Rev,2001,6(4):325-334.

[3]張?zhí)焯?內(nèi)皮素系統(tǒng)在慢性心力衰竭中作用的研究進展[J].國外醫(yī)學藥學分冊,2002,29(4):213-217.

[4]李天奇.內(nèi)皮素與心衰[J].心血管病學進展,2005,26(1):17-20.

[5]龔生蘭,施仲偉,于金德.充血性心力衰竭[M].上海:上?？茖W技術出版社,2004:44.

[6]彭艷,覃數(shù),劉劍,等.血脂康對慢性心力衰竭患者血清TNF2A和血管內(nèi)皮功能的影響[J].重慶醫(yī)學,2009,38(14):1771-1772.

[7]Naruse M,Naruse K,Demura H.Recent advances in endothelin research on cardiovascular and endocrine systems[J].Endocr J,1994,41(5):491-507.

[8]Yamamoto S,Matsumoto N,Kanazawa M,et al.Different contributions of endothelin-A and endothelin-B receptors in postischem ic candiac dysfunction and norepinephrine overflow in rat heants[J].Circulation,2005,111(3):302-309.

[9]Ohlstein E,Douglas S.Endothelin-I modulates vascular smooth muscle structure and vasanotion:implications in cardiovascular pathology[J].Drug Dev Res,1993,29(2):108-128.

[10]Levin ER.Endothelins[J].N Eng J Med,1995,333(6):356-363.

[11]Benigni A,Rernuzzi G.Endothelin antagonists[J].Lancet,1999,353(9):133-138.

[12]Dupuis J,Stewart DJ,Cemacek P,et al.Human pulmonary circulation is an important site for both clearance and production of endothelin-1[J].Circulation,1996,94(7):1578-1584.

[13]Wei CM,Lennan A,Rodeheffer RJ,et al.Endothelin in human congestive heart failure[J].Circulation,1994,89(4):1580-1586.

[14]M ulder P,Richard V,Derumeaus C,et al.Role of endogenous endothelin in chronic heart failure.Effect of longterm treatment with an endothelin antagonist on survival,hemodynamics,and cardiac remodelling[J].Circulation,1997,96(6):1976-1982.

[15]Lepailleur-enouf D,Egidy G,Philippe M,et al.Pulmonary endothelinergic system in experimental congestive heart failure[J].Cardiovas Res,2001,49(2):330-339.