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    發(fā)酵液中替考拉寧含量的HPLC法測(cè)定

    2011-08-13 08:04:54張波
    中國實(shí)用醫(yī)藥 2011年23期
    關(guān)鍵詞:拉寧液相色譜儀發(fā)酵液

    張波

    替考拉寧(Teicoplanin)為新型糖肽類抗生素,抗菌譜及抗菌活性與萬古霉素相似,對(duì)金黃色葡萄球菌的作用比萬古霉素更強(qiáng),不良反應(yīng)更少。本品對(duì)革蘭陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌和大多厭氧性革蘭陽性菌敏感,具有較強(qiáng)的殺菌活性。由于替考拉寧獨(dú)特的作用機(jī)制,很少出現(xiàn)耐替考拉寧的菌株,所以對(duì)青霉素類及頭孢菌素類,大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氯霉素類,氨基糖苷類和利福平耐藥的革蘭陽性菌,仍對(duì)替考拉寧敏感[1,2]。本文采用高效液相色譜法,乙腈-磷酸鹽體系作為流動(dòng)相,對(duì)發(fā)酵液中的替考拉寧含量測(cè)定方法進(jìn)行研究,結(jié)果滿意。

    1 儀器與試劑

    Waters1525型液相色譜儀(美國Waters公司),UV100型紫外檢測(cè)器,替考拉寧對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供),替考拉寧樣品(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);乙腈(色譜純,天津四友公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)-乙腈(75∶25),流速1.0 ml/min,檢測(cè)波長為 254 nm,進(jìn)樣量 10 μl。

    2.2 檢測(cè)波長的選擇 對(duì)替考拉寧對(duì)照品的流動(dòng)相溶液進(jìn)行紫外掃描,結(jié)果在254 nm附近有較大吸收,在此波長處發(fā)酵液無明顯干擾,故選擇254 nm作為檢測(cè)波長。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取替考拉寧對(duì)照品約20 mg,置10 ml容量瓶中,振搖,用流動(dòng)相溶解至刻度,作為供試品溶液,另取替考拉寧樣品適量,同法操作。

    2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取10 μl對(duì)照品溶液注入液相色譜儀,記錄色譜圖。在該色譜條件下,替考拉寧峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.2。

    2.5 破壞性試驗(yàn) 稱取替考拉寧對(duì)照品各約200 mg,分別置于3個(gè)100 ml容量瓶中,分別加入1 mol/L鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉,3%的過氧化氫溶液各10 ml,于室溫放置1 h,用流動(dòng)相定容,作為破壞后的供試品溶液,分別取10 μl注入液相色譜儀,結(jié)果替考拉寧與雜質(zhì)分離良好。

    2.6 線性關(guān)系 精密稱取替考拉寧對(duì)照品適量,分別制成每1 ml中含替考拉寧 500.0,1000.0,2000.0,3000.0,4000.0,5000.0 μg的溶液,注入液相色譜儀,以替考拉寧峰面積A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo),計(jì)算得回歸方程為:

    A=487939 C,r=0.9988

    2.7 最低檢測(cè)限 采用逐級(jí)稀釋法,以S/N≥3為最低檢出限,測(cè)得最低檢測(cè)限為4.50ng。

    2.8 精密度試驗(yàn) 試驗(yàn)按2.3項(xiàng)下配制的2000 μg/ml的溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算其RSD為0.55%。

    2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的替考拉寧樣品,制成2.3項(xiàng)下濃度的替考拉寧供試品溶液,共6份,分別精密加入含已知量的對(duì)照品溶液,搖勻,取10 μl進(jìn)樣,結(jié)果替考拉寧的平均回收率為100.2%(RSD=0.14%,n=6)。結(jié)果見表1

    2.10 發(fā)酵液中樣品測(cè)定 取約20 ml發(fā)酵液用2 mol/L氫氧化鈉調(diào) pH=11,攪拌10 min,在3000轉(zhuǎn)/min下離心10 min,取上清液,以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至8.5,取調(diào)后上清液,過濾。取稀釋配制成約2000 μg/ml的溶液,搖勻,過濾,取10 μl進(jìn)樣,結(jié)果在此色譜條件下,發(fā)酵液中雜質(zhì)對(duì)主峰無干擾,分析重復(fù)性及精密度結(jié)果較滿意。

    表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    本文采用乙腈-磷酸鹽體系作為流動(dòng)相對(duì)替考拉寧進(jìn)行樣品測(cè)定,精密度好,色譜峰對(duì)稱性也較好,同時(shí)我們還對(duì)樣品溶液經(jīng)過不同時(shí)間的放置來檢驗(yàn)樣品在溶液中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)樣品在本流動(dòng)相溶液中相當(dāng)穩(wěn)定,適宜于成品的檢測(cè)和發(fā)酵液中間體的質(zhì)量控制。

    [1]夏振強(qiáng),古勇,官家發(fā).糖肽類抗生素替考拉寧研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,18(2):236-238.

    [2]何禮賢,潘玨,陳世耀,等.替考拉寧治療革蘭陽性球菌感染的臨床研究.中華內(nèi)科雜志,2005,33(5):532-533.

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