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    母胎界面MCP-1表達(dá)異常與不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系

    2011-08-13 00:40:48李俊霞
    中國計劃生育學(xué)雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:母胎蛻膜絨毛

    張 鈺 李俊霞 顧 艷 李 奕

    天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計劃生育科(300211)

    早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(ERSA)發(fā)病率為3% ~5%。排除臨床上可明確的病因(染色體、解剖、內(nèi)分泌及感染因素),仍有近1/2的ERSA病因未明,稱不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(UERSA)。隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展,逐步認(rèn)識到UERSA是一種同種免疫病,其發(fā)病可能是由于母胎界面種植部位局部細(xì)胞功能的異常和細(xì)胞因子的分泌異常[1],但導(dǎo)致UERSA的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。單核細(xì)胞趨化蛋白 -1(MCP-1)是在體外最早發(fā)現(xiàn)的具有趨化活性的細(xì)胞因子之一,屬于趨化因子家族。文獻(xiàn)已證實早孕絨毛和蛻膜組織中均有MCP-1的表達(dá),母胎界面產(chǎn)生的MCP-1與蛻膜局部的單核巨噬細(xì)胞的募集與激活有關(guān)[2,3],但其與UERSA發(fā)病的研究尚未見報道。本研究通過篩選UERSA患者,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法,研究UERSA患者絨毛和蛻膜組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)異常及血清MCP-1的蛋白含量與UERSA發(fā)病的相關(guān)性,為臨床建立有效的監(jiān)測指標(biāo)和成功的治療方案提供理論依據(jù)。

    1 對象與方法

    1.1 對象

    在知情同意下,選擇2008年6月~2009年6月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計劃生育科就診的UERSA患者30例(UERSA組),超聲檢查提示胚胎發(fā)育停止或孕卵枯萎,無胎心搏動。UERSA患者應(yīng)符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]:①與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生至少2次自然流產(chǎn),流產(chǎn)孕周為7~12周;②夫婦外周血染色體核型均正常;③生殖器官解剖結(jié)構(gòu)未見異常;④內(nèi)分泌激素(如性激素、血糖、胰島素水平和甲狀腺功能)均正常;⑤血清TORCH-IgM檢測陰性,宮頸分泌物衣原體、解脲支原體檢測均為陰性;⑥自身抗體陰性(外周血抗心磷脂抗體陰性,抗β2-糖蛋白1抗體陰性,狼瘡抗凝物陰性)。同期隨機(jī)收集自愿要求終止妊娠的健康早孕婦女30例為對照組,無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史,孕周7~12周,B超提示胚胎發(fā)育正常,本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)的癥狀和體征,未放置宮內(nèi)節(jié)育器。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本采集及處理所有受試對象完善血常規(guī)、心電圖、白帶常規(guī)等各項檢查,未發(fā)現(xiàn)異常后行負(fù)壓吸宮手術(shù)。手術(shù)前采集肘靜脈血5ml,室溫靜置2h后,2 500r/min離心15min,取上清液放入凍存管,置于-80℃冰箱凍存待測。手術(shù)后,無菌條件下選取絨毛、蛻膜組織約0.3g,立刻用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的無菌磷酸鹽緩沖液漂洗,置于凍存管封存,液氮保存。

    1.2.2 實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測絨毛、蛻膜組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)①主要試劑:RNAiso Plus、RT-PCR試劑盒、熒光染料SYBR Green購自大連寶生物工程有限公司。熒光定量PCR儀:LightCycler(Roche公司)。②引物的設(shè)計和合成:根據(jù)Gen-Bank所發(fā)布的基因序列,由天津六合通生物技術(shù)有限公司設(shè)計和合成。MCP-1上游引物序列:5'-CAATCAATGCCCCAGTCACC-3',下游引物序列:5'-CCTGAACCCACTTCTGCTTG-3'。選擇 β -actin為內(nèi)參照基因,其上游引物序列:5'-GCAAAGACCTGTACGCCAAC-3',下游引物序列5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。③絨毛、蛻膜組織中MCP-1 mRNA的檢測:提取絨毛、蛻膜組織總RNA,按RTPCR試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。實時熒光定量RT-PCR總反應(yīng)體系為:cDNA模板1μl,上、下游引物各 0.3μl,SYBY Green 染料 10μl,用雙蒸水補足至20μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10s,95℃變性5s、60℃退火20s、72℃延伸10s,共40 個循環(huán),并且做熔解曲線和擴(kuò)增曲線分析。④數(shù)據(jù)分析:根據(jù)Livak和Schmittgen[5]設(shè)計的比較閾值法來測定目的基因的相對表達(dá),目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct。

    1.2.3 血清MCP-1蛋白含量測定Human MCP-1 ELISA測定試劑盒由美國R&D公司提供,嚴(yán)格按說明書操作。用Model 680酶標(biāo)儀(Sanyo,Japan)在450nm波長依序測量各孔的OD值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出相應(yīng)的MCP-1濃度。

    1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析所得數(shù)據(jù)以±s的形式表示,應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0分析處理,計量資料分析采用Student-t檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組婦女臨床相關(guān)指標(biāo)比較

    UERSA組和正常早孕組的年齡、孕次、停經(jīng)天數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),具有可比性。UERSA組因為胚胎停育,胎囊小于正常早孕組(<0.05)。見表1。

    2.2 早孕絨毛、蛻膜組織MCP-1mRNA的表達(dá)

    本實驗采用實時熒光定量RT-PCR技術(shù),MCP-1基因的熔解曲線和擴(kuò)增曲線見圖1、2。熔解曲線提示本實驗?zāi)康幕驍U(kuò)增的特異性較高,擴(kuò)增曲線提示本實驗擴(kuò)增質(zhì)量良好。實驗結(jié)果表明正常早孕婦女和UERSA患者絨毛、蛻膜組織均可見MCP-1mRNA的表達(dá),絨毛、蛻膜組織MCP-1與內(nèi)參基因β-actin濃度比值分別為1.68 ±0.42,2.30 ±0.86,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

    2.3 兩組絨毛、蛻膜組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)量和血清中MCP-1蛋白含量的比較

    UERSA組絨毛和蛻膜組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于正常早孕組(P<0.01);UERSA組血清中MCP-1蛋白的含量顯著高于正常早孕組(P <0.01)。見圖3、4。

    表1 兩組研究對象一般情況比較(±s)

    表1 兩組研究對象一般情況比較(±s)

    *與UERSA組比較P<0.05

    組別 例數(shù) 年齡(歲) 孕次 停經(jīng)天數(shù) 胎囊大小(mm)UERSA 組 30 28.42 ±4.55 3.94 ±0.56 75.23 ±6.05 34.34 ±6.95正常早孕組 30 27.63 ±4.16 3.06 ±0.85 72.46 ±6.53 48.41 ±3.30*

    2.4 血清MCP-1蛋白含量與絨毛、蛻膜組織中MCP-1mRNA表達(dá)量的相關(guān)性

    UERSA組和對照組血清中MCP-1蛋白含量與絨毛組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)量之間呈正相關(guān)(r=0.595,P <0.05),與蛻膜組織中 MCP-1mRNA的表達(dá)量之間也呈正相關(guān)(r=0.655,P<0.05),見圖 5、6。

    3 討論

    3.1 母胎界面MCP-1的表達(dá)與正常早期妊娠的維持

    從免疫學(xué)角度而言,自然妊娠是一種特殊類型的“半同種異體移植”。胚胎種植的免疫過程受胚胎和母體兩方面的共同調(diào)節(jié),發(fā)生在母胎界面的免疫反應(yīng)使胚胎能夠成功侵入子宮內(nèi)膜并使子宮內(nèi)膜的血管發(fā)生重鑄,從而使胚胎能夠從母體得到良好的血液供養(yǎng)而發(fā)育成熟[6]。母胎界面的胎兒面主要由絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞組成,母體-蛻膜面富集著母方來源的免疫活性細(xì)胞,由子宮自然殺傷細(xì)胞(uNK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞組成。已有研究表明,母胎界面局部免疫活性細(xì)胞并非源于前體細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的自我更新,而是從外周血中被募集遷移而來的。趨化因子MCP-1在單核-巨噬細(xì)胞的遷移、募集和歸巢中發(fā)揮決定性作用,參與胚胎種植階段母胎界面的免疫反應(yīng)[7,8]。本研究結(jié)果顯示,在早孕絨毛和蛻膜組織中共表達(dá)MCP-1 mRNA,且在蛻膜的表達(dá)高于絨毛,提示MCP-1可能參與復(fù)雜的母胎界面的整合性調(diào)控,在蛻膜巨噬細(xì)胞的招募和遷移中發(fā)揮重要作用。推測胎盤絨毛和蛻膜組織可能通過自分泌和旁分泌MCP-1調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜免疫活性細(xì)胞的功能,從而調(diào)節(jié)母胎免疫耐受,最終成功妊娠。

    3.2 絨毛、蛻膜組織中MCP-1mRNA的表達(dá)與UERSA

    目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞活性和功能的異常是導(dǎo)致母胎免疫耐受失衡、發(fā)生 UERSA 的重要原因[9,10],病理機(jī)制可能是:①巨噬細(xì)胞被激活后,可造成腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1等炎癥細(xì)胞因子水平升高,高濃度的炎癥細(xì)胞因子可以通過多種途徑導(dǎo)致流產(chǎn)[11];②巨噬細(xì)胞激活后不能及時清除凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞,凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞蓄積,可引發(fā)針對胎兒抗原的免疫攻擊;③巨噬細(xì)胞激活后可激發(fā)Thl型免疫反應(yīng),促使母體排斥胚胎組織[12],最終導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。體外試驗研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜接觸時會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞大量分泌MCP-1,從而吸引外周血中的單核細(xì)胞和蛻膜組織中的巨噬細(xì)胞不斷聚集在種植部位并激活,激活的巨噬細(xì)胞在滋養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)下分泌誘導(dǎo)局部免疫抑制反應(yīng)以及營養(yǎng)胚胎的細(xì)胞因子。如果提升蛻膜組織中MCP-1的濃度,會使巨噬細(xì)胞的招募變得不可抑制,而升高內(nèi)膜中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1等的濃度,均可誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá),這將構(gòu)成一個正反饋放大環(huán)路[13,14]。米亞英等[15]研究發(fā)現(xiàn):自然流產(chǎn)小鼠模型蛻膜組織中MCP-1、TNF - α 的表達(dá)顯著升高,Chaiworapongsa等[16]發(fā)現(xiàn),羊水中MCP-1水平升高是自然流產(chǎn)的一個危險因素,這些研究均提示MCP-1的表達(dá)與自然流產(chǎn)的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)UERSA組絨毛、蛻膜組織中MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著高于正常妊娠組,提示母胎界面MCP-1表達(dá)上調(diào)可能與UERSA的發(fā)病有關(guān),MCP-1參與了自然流產(chǎn)過程。推測MCP-1可能是巨噬細(xì)胞參與母胎界面免疫反應(yīng)的始動因素,母胎界面MCP-1表達(dá)上調(diào),直接導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞的數(shù)量和免疫活性異常,數(shù)量增多、功能增強(qiáng)的巨噬細(xì)胞再分泌大量的MCP-1,誘導(dǎo)更多巨噬細(xì)胞聚集,由此產(chǎn)生級聯(lián)放大作用,發(fā)揮免疫效應(yīng),可能是最終導(dǎo)致胚胎死亡的重要機(jī)制。

    3.3 血清MCP-1蛋白含量和絨毛、蛻膜組織中MCP-1-mRNA表達(dá)的相關(guān)性及意義

    胚胎發(fā)育停止在臨床上屬于稽留流產(chǎn)的范疇,如不及時診斷、治療,胚胎可發(fā)生機(jī)化,與子宮壁粘連,在清宮術(shù)中易導(dǎo)致子宮穿孔、吸宮不全、子宮出血、感染等嚴(yán)重的并發(fā)癥,增加清宮手術(shù)的難度。目前對妊娠早期胚胎發(fā)育的監(jiān)測主要通過超聲檢查和血清人絨毛膜促性腺激素(hCG)的測定來完成,B超下孕卵形態(tài)或位置的改變,胎心的消失,血hCG的明顯降低都能較準(zhǔn)確地指示流產(chǎn)的發(fā)生。然而B超和血hCG測定預(yù)測胚胎發(fā)育不良仍有一些不足之處,當(dāng)患者停經(jīng)天數(shù)較少、月經(jīng)不規(guī)律、B超未見胚胎心管搏動時,僅憑B超檢查無法確定胚胎發(fā)育情況,往往需連續(xù)觀察數(shù)周。而血清hCG半衰期長,濃度變異范圍較大,正常早期妊娠與稽留流產(chǎn)之間交叉部分較大,且單次測定可能存在誤差,因此僅憑測定hCG也不足以診斷。故能否找到一些更有價值的指標(biāo)來監(jiān)測胚胎停育,為胚胎發(fā)育不良的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療提供幫助,成為眾多學(xué)者廣泛研究的問題。目前已有報道,某些細(xì)胞因子對自然流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局有一定的預(yù)測作用[17,18],但國內(nèi)外關(guān)于此方面的研究頗少。如前所述,母胎界面MCP-1是絨毛和蛻膜組織共同分泌的,是妊娠早期成功種植胚胎和胎盤形成過程中重要的決定因素,與自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。但直接進(jìn)行絨毛和蛻膜活檢檢測MCP-1表達(dá)是侵入性方法,可能引起流產(chǎn)和胚胎損傷。本研究發(fā)現(xiàn),UERSA組血清中MCP-1蛋白的含量高于正常早孕組,且血清中MCP-1含量與母胎界面MCP-1 mRNA表達(dá)水平有良好的相關(guān)性,提示可以通過檢測孕母血清MCP-1的水平來反應(yīng)母胎界面MCP-1 mRNA的表達(dá)水平。通過監(jiān)測孕母血清MCP-1的水平評價胚胎發(fā)育情況,作為鑒別正常早期宮內(nèi)妊娠和胚胎發(fā)育不良的診斷依據(jù),對于早期診斷胚胎停育具有重要意義。

    總之,通過上述研究提示母胎界面絨毛、蛻膜組織MCP-1高表達(dá),可能導(dǎo)致蛻膜巨噬細(xì)胞數(shù)量和活性改變而直接影響母胎間的免疫平衡,最終導(dǎo)致UERSA的發(fā)生。這一結(jié)果將有利于深入探討改變母胎界面MCP-1表達(dá)在UERSA治療中的可行性。

    1 林其德,汪希鵬.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因病理生理機(jī)制與治療臨床進(jìn)展[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2007,23(1):5-8.

    2 Meter RA,Wira CR,F(xiàn)ahey JV,et al.Secretion of monocyte chemotactic protein-1 by human uterine epithelium directs monocyte migration in culture[J].Fertil Steril,2005,84(1):191 - 201.

    3 馬方,杜美蓉,李大金.早孕期人絨毛趨化因子CCL2及其受體CCR2的表達(dá)[J].生殖與避孕,2009,29(11):755-758.

    4 林其德.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)免疫學(xué)診斷和治療共識[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2008,17(1):4 -5.

    5 Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402 -408.

    6 王瓊,周燦權(quán).胚胎種植與免疫[J].中國實用婦科與產(chǎn)科,2007,23(12):898-900.

    7 Bonecchi R,Galliera E,Borroni EM,et al.Chemokines and chemokine receptors:an overview[J].Front Biosci,2009,14:540 -551.

    8 Red-Horse K,Drake PM,F(xiàn)isher SJ.Human pregnancy:the role of chemokine networks at the fetal- maternal interface[J].Expert Rev Mol Med,2004,6(11):1 -14.

    9 Renaud SJ,Graham CH.The role of macrophages in utero-placental interactions during normal and pathological pregnancy[J].Immunol Invest,2008,37(5):535 -564.

    10 金妍,林其德,汪希鵬,等.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者巨噬細(xì)胞表面TSP1、CD36、CD47的表達(dá)及其細(xì)胞因子的分泌.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2006,15(2):926 -929.

    11 Yu XW,Yan CF,Jin H,et al.Tumor ncrosis factor receptor 1 expression and early spontaneous abortion[J].Int J Gynecol Obstet,2005,88(1):44 -48.

    12 Mor G,Abrahams VM.Potential role of macrophages as immunnoregulators of pregnancy[J].Reprod Biol Endocrinol,2003,1:119.

    13 Fest S,Aldo PB,Abrahams VM,et al.Trophoblast-macrophage interactions:a regulatory network for the protection of pregnancy[J].Am J Reprod Immunol,2007,57(1):55 -66.

    14 Lockwood CJ,Matta P,Krikun G,et al.Regulation of monocyte chemoattractant protein-1 expression by tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta in first trimester human decidual cells:implicationsfor preeclampsia[J].Am J Pathol,2006,168(2):445 -452.

    15 米亞英,楊俊英.自然流產(chǎn)小鼠蛻膜組織腫瘤壞死因子-α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)[J].中國計劃生育學(xué)雜志,2007,15(7):411-413.

    16 Chaiworapongsa T,Romew R,Tolosa JE,et a1.Elevated monocyte chemotactic protein-1 in amniotic fluid is a risk factor for pregnancy loss[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2002,12(3):159 -164.

    17 Whitcomb BW,Schisterman EF,Klebanoff MA,et al.Circulating Chemokine Levels and Miscarriage[J].Am J Epidemiol,2007,166(3):323-331.

    18 van Mourik MS,Macklon NS,Heijnen CJ.Embryonic implantation:cytokines,adhesion molecules,and immune cells in establishing an implantation environment[J].J Leukoc Biol,2009,85(1):4 -19.

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