環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)豬細(xì)小病毒的試驗(yàn)

黃書(shū)林，付 萍，李佳禾，張躍偉，蔣 菲，張 侃，陳會(huì)玲，吳文學(xué)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.中國(guó)牧工商（集團(tuán)）總公司中牧研究院，北京 豐臺(tái) 100070）

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒（PPV）感染引起母豬繁殖障礙的重要病原體之一，主要引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等。近年來(lái)，豬細(xì)小病毒病有上升的趨勢(shì)，并且該病常常與豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒，偽狂犬病病毒等發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失［1-2］。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)［3］，具有高特異性、高敏感性、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［4-6］。本試驗(yàn)針對(duì)豬細(xì)小病毒NS-1基因設(shè)計(jì)引物，建立了豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 毒株及病料來(lái)源 豬細(xì)小病毒7909株、NADL-2株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬繁殖與呼吸綜合征病毒標(biāo)準(zhǔn)株（VR-2332）、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬瘟病毒（C株）、弓形蟲(chóng)（RH株）的核酸樣品，由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。疑似PPV感染流產(chǎn)胎兒組織病料采自北京周邊地區(qū)、山東濰坊等地規(guī)?；i場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 核酸DNA的提取 采用基因組DNA提取試劑盒（TransGen）提取PPV 7909株、NADL-2株的細(xì)胞培養(yǎng)物和組織樣本DNA，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP引物的設(shè)計(jì) 在GenBank下載了NS-1基因全長(zhǎng)序列，利用生物學(xué)軟件DNAStar的MegAlign軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析，選取NS-1基因同源性高即保守區(qū)域，使用在線(xiàn)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并篩選出PPV特異的6條引物（表1及圖1）。

表1 所設(shè)計(jì)的引物

圖1 豬細(xì)小病毒LAMP各引物的名稱(chēng)與順序和各引物在基因組中對(duì)應(yīng)的位置

1.2.3 LAMP反應(yīng)的建立 參照日本榮研株式會(huì)社生產(chǎn)LAMP試劑盒，優(yōu)化后的25μL反應(yīng)體系為：4μL Tris-HCl（125mmol／L），2μL MgSO4（100mmol／L），2μL KCl（125mmol／L），2μL（NH4）2SO4（125mmol／L），0.4μL Betaine（50 mol／L），0.025μL 0.2%Tween 20，dNTPs（100 mmol／L）各0.3μL，12UBst DNA 聚合酶（New England Biolabs），此外，體系中引物 FIP（40 mmol／L）、BIP（40mmol／L）、F3（5mmol／L）、B3（5 mmol／L）、LF（20mmol／L）、LB（20mmol／L）各1 μL，2μL模板DNA，加雙蒸水至25μL。

反應(yīng)通過(guò)LA-200實(shí)時(shí)濁度儀（Teramecs，Japan）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。反應(yīng)產(chǎn)物若經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型“梯形”條帶，則判定為陽(yáng)性。置于LA-200實(shí)時(shí)濁度儀（日本）中63℃恒溫反應(yīng)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)液的濁度變化。以反應(yīng)液濁度達(dá)到0.1判為陽(yáng)性。反應(yīng)45min結(jié)束，以檢量曲線(xiàn)的形式展示反應(yīng)結(jié)果。同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物還通過(guò)2%葡萄糖瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 PCR反應(yīng) 以豬細(xì)小病毒NS-1基因（Gen-Bank登錄號(hào)：NC-001718）為靶序列設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物：5′-TAGGATGCGAGGAAAGAC-3′，下游引物：5′-GGAGTTAAGTGCAGGTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為400bp。25μL PCR反應(yīng)體系，包括12.5μL 2xTaq PCR SuperMix（TransGen），上下游引物（25μmol／L）各0.6μL，2μL模板DNA，加雙蒸水至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，之后94℃變性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.5 LAMP與PCR的敏感性 本試驗(yàn)針對(duì)LAMP和PCR檢測(cè)的共同擴(kuò)增區(qū)域序列構(gòu)建重組質(zhì)粒。以豬細(xì)小病毒NADL-2株DNA為模板，使用上述1.2.4中的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物（400bp）連接于pEASY-T1Cloning Vector載體（TransGen），構(gòu)建含有目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)分光光度計(jì)法測(cè)定并計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度，進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋?zhuān)官|(zhì)粒在反應(yīng)體系中的分布為106～100個(gè)拷貝／25μL，取一定量質(zhì)粒，分別進(jìn)行LAMP和PCR檢測(cè)。

1.2.6 LAMP與PCR特異性 將豬繁殖與呼吸綜合征病毒標(biāo)準(zhǔn)株（VR-2332）、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬瘟病毒（豬瘟兔化弱毒株，C株）和弓形蟲(chóng)（RH株）作為模板，分別進(jìn)行LAMP和PCR方法的特異性檢測(cè)。

1.2.7 熒光指示劑的應(yīng)用［4］將反應(yīng)體系中加入含有0.625mmol／L鈣黃綠素和 Mn2+3.75mmol／L的熒光指示劑2μL。將105.0TCID50／100μL的PPV 7909株細(xì)胞病毒液提取全基因組DNA作為模板，經(jīng)63℃恒溫反應(yīng)45min，反應(yīng)結(jié)束后觀察溶液顏色變化。

1.2.8 臨床樣本檢測(cè) 采集疑似病例的流產(chǎn)胎兒組織149份，-20℃保存。稱(chēng)取適量組織樣本按w／v為1∶1加入0.9%氯化鈉溶液，經(jīng)研磨后，提取組織樣本全基因組DNA。用已建立的LAMP和PCR方法檢測(cè)，比較兩種方法的陽(yáng)性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP和PCR的敏感性 設(shè)定反應(yīng)產(chǎn)物濁度值超過(guò)0.1時(shí)，即作為陽(yáng)性判定。敏感性試驗(yàn)顯示，LAMP方法能在60min內(nèi)檢測(cè)出10個(gè)拷貝質(zhì)粒（圖2A），PCR方法僅能檢測(cè)到103拷貝質(zhì)粒（圖2B）。表明建立的LAMP方法的檢測(cè)極限高于PCR方法100倍。

2.2 LAMP與PCR的特異性 利用2株豬細(xì)小病毒和其他4株病原來(lái)檢測(cè)LAMP和PCR方法的特異性。結(jié)果顯示，兩種方法能特異性擴(kuò)增豬細(xì)小病毒兩種毒株，而其他病原均無(wú)特異性擴(kuò)增（圖3）。表明兩種方法都有很好的特異性。

2.3 熒光指示劑的應(yīng)用 顯色試驗(yàn)結(jié)果表明，在反應(yīng)體系中加入含有鈣黃綠素與Mn2+的作為熒光指示劑，陽(yáng)性樣品由棕黃色變?yōu)榱辆G色，反應(yīng)前后顏色變化及陰陽(yáng)性對(duì)比明顯，說(shuō)明該熒光指示劑可用于判定LAMP反應(yīng)結(jié)果（圖4）。

圖4 熒光指示劑在LAMP的可視化應(yīng)用

2.4 臨床樣本的檢測(cè) 用LAMP和PCR方法檢測(cè)149份流產(chǎn)胎兒組織樣本DNA。結(jié)果（表2）表明，LAMP方法陽(yáng)性檢出率22.1%（33／149），高于PCR方法的陽(yáng)性檢出率18.1%（27／149）。

表2 臨床檢測(cè)結(jié)果（n=149）

3 討論

目前已有常規(guī)PCR、多重PCR、Real-time PCR和Nest-PCR等方法檢測(cè)細(xì)小病毒，且多選擇高度保守的NS-1基因作為檢測(cè)的靶基因［7-8］。在本文中，我們同樣選取了該基因上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了數(shù)套引物，并通過(guò)陰性和陽(yáng)性篩選，獲得1套高效、特異LAMP引物，建立了最佳反應(yīng)體系。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法能在63℃的恒溫反應(yīng)45min即可判定結(jié)果。敏感性試驗(yàn)表明，LAMP方法最低能檢出10個(gè)拷貝數(shù)的PPV基因組，相當(dāng)于0.1 TCID50／100μL，比常規(guī)PCR方法高100倍，與先前報(bào)道的該病原的LAMP方法靈敏度相當(dāng)［8-9］。對(duì)多種病原基因組進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)交叉反應(yīng)，顯示良好的特異性。此外，通過(guò)對(duì)149份臨床樣本檢測(cè)，結(jié)果證明，LAMP的陽(yáng)性檢出率（22.1%）要高于PCR方法（18.1%），也進(jìn)一步證明了LAMP具有更高的靈敏度。因此，可確定本試驗(yàn)建立的LAMP方法適用于PPV檢測(cè)的高敏感性和特異性的方法。

為了避免氣溶膠造成假陽(yáng)性的問(wèn)題，我們通過(guò)在反應(yīng)前體系中加入鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察其顏色變化即可快速判定結(jié)果，這使得LAMP方法在臨床檢驗(yàn)上具有廣闊的應(yīng)用前景，為早期診斷、防制和凈化提供了一種新方法。

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