康寧木霉固態(tài)發(fā)酵生產纖維素酶與木聚糖酶的研究

鄒水洋 劉傳生 朱丹

(東莞理工學院 化學與環(huán)境工程學院，廣東東莞 523808)

地球上最大的一類可再生有機資源——木質纖維素的生物轉化與利用是全世界普遍關注的重大課題。然而，酶使用成本過高是這一生物技術遲遲難以產業(yè)化的重要障礙［1］。纖維素酶和木聚糖酶是轉化木質纖維素原料生成可發(fā)酵性還原糖的主要水解酶，提高這兩大類酶的生產水平是降低用酶成本的重要途徑，也是該領域主要的研究方向之一。

纖維素酶和木聚糖酶的生產方法有液態(tài)發(fā)酵法和固態(tài)發(fā)酵法，這兩種方法各有優(yōu)劣。一般認為，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件易控制，生產效率高，產品品質穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產，但投資費用及運行成本較高［1］。而固態(tài)發(fā)酵由于其特有的經濟、實用性，近年來在纖維素酶和木聚糖酶的生產方面已經引起了廣泛的重視［1-3］。以前曾對一株纖維素酶和木聚糖酶的高產菌——康寧木霉QF-02的液態(tài)發(fā)酵工藝開展了系列研究，并達到了較高的產酶水平［4-5］。為進一步拓展該菌種的生產應用，本文對其固態(tài)發(fā)酵工藝進行研究，并采用稻草和麩皮這類廉價的原料作為主要的培養(yǎng)基質以降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:康寧木霉 (Trichoderma koningii)QF-02由東莞理工學院微生物實驗室保存。

原料:稻草、麩皮粉碎，75℃烘干，過20目篩備用。

試劑:Whatman 1#濾紙、木聚糖、水楊素由Sigma公司生產 (用于酶活力測定)，其它化學試劑均為國產分析純或生化試劑。

菌種保藏培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)。

Mandels營養(yǎng)液［6］:0.75 g蛋白胨，0.25 g酵母膏，0.3 g脲，1.4 g(NH4)2SO4，2.0 g KH2PO4，0.4 g CaCl2·H2O，0.5 mg FeSO4·7H2O，4.0 mg ZnSO4·7H2O，2.0 mg CoCl2·6H2O，溶于1000 mL蒸餾水中。

種子液培養(yǎng)基:1.0 g葡萄糖溶于100 mL Mandels營養(yǎng)液中，于110℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:稻草粉、麩皮按質量比 (w/w)3∶2混合，總量5 g，裝于250 mL錐形瓶中，加入pH 5.0的Mandels營養(yǎng)液7.5 mL，攪拌均勻，于121℃滅菌20 min。本培養(yǎng)基為發(fā)酵初始培養(yǎng)基，在研究過程中工藝條件的改變將另行指出。

1.2 實驗方法

種子液制備:菌種在PDA培養(yǎng)基上28.5℃培養(yǎng)7天，長滿孢子后冷藏備用。從斜面培養(yǎng)基上取孢子一環(huán)接種到種子液培養(yǎng)基，于28.5℃、150 r/min轉速下培養(yǎng)48 h。

固態(tài)發(fā)酵:在固態(tài)培養(yǎng)基中接入種子懸浮液1.0 mL，充分攪拌后在SPX-250型生化培養(yǎng)箱28.5℃靜置培養(yǎng)4天。以上實驗均平行做3個樣品，實驗結果取其平均值，標準偏差小于5%。

粗酶液的制備:將固態(tài)培養(yǎng)物加入100 mL蒸餾水，在40℃下振蕩 (60 r/min)浸提2 h;然后用棉花過濾，濾液經4000 r/min離心15 min去除孢子，上清液即為粗酶液。

1.3 檢測方法

濾紙酶活 (FPA)和β-葡萄糖苷酶活的測定參照 Mandels等人的測定方法［7］，酶解底物分別為Whatman 1#濾紙和水楊素，以葡萄糖為標準按DNS法定糖。木聚糖酶活的測定根據文獻［8］略加修改:取適當稀釋的酶液0.5 mL，加入1.0 mL質量分數(shù)為1%的木聚糖溶液 (木聚糖溶于pH 4.5的0.1 mol/mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中)，于50℃保溫15 min，以木糖為標準按DNS法定糖。以上酶活測定中均以底物空白與酶液空白的算術和作為總空白值處理［9］。酶活力以每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力國際單位 (IU)。固體曲的活力以每克干曲計。

2 結果與討論

2.1 稻草粉和麥麩比例對產酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵生產纖維素酶或木聚糖酶的工藝中一般都會用到一種纖維素原料 (如稻草、蔗渣、麥糟等)與麩皮按一定比例混合作為固態(tài)基質。從實驗結果 (表1)來看，稻草粉與麩皮比例為3∶2(w/w)時，T.koningii QF-02所產生的纖維素酶活和木聚糖酶活均最高。在混合基質中，纖維素物質可作為碳源和產酶誘導物。而麩皮的作用比較微妙，有人認為麩皮含有促進微生物生長和產酶的因子，且能吸收水分保持濕潤;但麩皮用量過大使培養(yǎng)基粘性增大、不利于透氣，從而影響霉菌的生長和酶的分泌［10］。筆者認為過多的麩皮除了上述不利影響外，可能還會導致營養(yǎng)過剩而降低酶產量，因為纖維素酶和木聚糖酶一般需要在易利用碳源相對貧乏的狀態(tài)下產生。

T.koningii QF-02在液態(tài)發(fā)酵生產的纖維素酶系中，β-葡萄糖苷酶活相對較低［4-5］，與FPA的比值在1∶3～4，但在本研究中這一比值接近1∶1，表明纖維素酶系組成更趨合理，這可能是固態(tài)發(fā)酵更符合康寧木霉的自然生長習性的緣故。但木聚糖酶與FPA的比值與液態(tài)發(fā)酵相比有所下降。

表1 稻草與麩皮比例對產酶的影響 IU/g

2.2 原料粒度對產酶的影響

在研究T.koningii QF-02的液態(tài)發(fā)酵過程中，曾發(fā)現(xiàn)原料粒徑對產酶也有一定影響，因此本實驗將20目、20～40目、40目粒徑的稻草與麩皮原料配制成培養(yǎng)基，考察不同粒度對T.koningii QF-02產酶的影響。

實驗結果 (圖1)顯示，原料粒徑在20～40目時所得酶活最高，20目時酶活略低，40目時差距較大。這可能是由于原料過細，培養(yǎng)基容易板結，影響到氧氣和熱量的傳遞，不利于菌體的生長，從而降低了酶的產量;而原料過粗使菌種對原料的利用率降低，同樣會影響到酶的產量。但采用20～40目的原料會造成較多細小顆粒的浪費，從節(jié)約原料與提高產量綜合考慮，以下實驗均取用20目的稻草粉和麩皮為原料。

2.3 培養(yǎng)基料液比對產酶的影響

圖1 原料粒度對產酶的影響

Mandels營養(yǎng)液包含復合氮源、礦物質及生長因子，其添加量還決定培養(yǎng)基的潮濕程度。實驗中發(fā)現(xiàn)，水分太少時，固體培養(yǎng)基外觀干燥、松散，菌體生長所需的水分及營養(yǎng)供應不足，代謝減弱，造成酶產量較低;水分過多時，培養(yǎng)基聚集呈塊狀，使透氣性下降，有氧呼吸減弱，同化作用受到抑制［11］，酶的產量也降低。當料液比為1∶1.5(w/v)時，培養(yǎng)基全部潤濕，結構蓬松分散，菌體對固體料的利用率較高，酶產量也是各種料液比中最高的 (如表2所示)。以下實驗的料液比均采用1∶1.5。

表2 培養(yǎng)基料液比對產酶的影響 IU/g

2.4 培養(yǎng)基起始pH值對產酶的影響

Mandels營養(yǎng)液中含較多的KH2PO4，緩沖能力強，本實驗用 H2SO4和 NaOH來調節(jié)其pH值分別為:4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5來考察pH值的改變對產酶的影響，實驗結果如圖2所示。隨著起始pH值的升高，固體發(fā)酵所產生的纖維素酶和木聚糖酶的活力都逐漸升高，在pH 5.5時酶活最高，隨后下降明顯。T.koningii QF-02在液態(tài)發(fā)酵時產酶的最適pH在4.5～5.0［4-5］，在固態(tài)發(fā)酵中最適產酶pH的升高可能與該菌所處的生長環(huán)境發(fā)生了重大變化有關。以下實驗的起始pH值均調節(jié)為5.5。

圖2 培養(yǎng)基起始pH值對產酶的影響

2.5 培養(yǎng)時間對產酶的影響

圖3 培養(yǎng)時間對產酶的影響

培養(yǎng)開始后每隔24 h定時取樣測定三種酶的活力，直到168 h發(fā)酵過程結束。實驗中觀察到培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基表面就有大量白色菌絲生長，48 h后發(fā)現(xiàn)有綠色孢子出現(xiàn)，120 h后孢子覆蓋整個培養(yǎng)基。從酶活測定結果 (圖3)來看:培養(yǎng)時間在96 h以前，三種酶的活力升高迅速，是主要產酶階段;96 h～120 h增加較少，120 h FPA、β-葡萄糖苷酶活、木聚糖酶活均達到峰值，分別為13.1 IU/g(干曲)、12.2 IU/g(干曲)、994.7 IU/g(干曲)。此時，應及時收獲酶，否則酶活力隨即下降。究其原因，一方面是因為酶的合成基本停止，另一方面由于內源性蛋白酶的水解作用［12］，目標酶蛋白會逐漸變性失活。

3 結論

菌種T.koningii QF-02在稻草粉與麩皮比為3∶2，粒徑為20目，料水比為1∶1.5，起始pH值5.5，28.5℃培養(yǎng)120 h的優(yōu)化培養(yǎng)條件下達到了同類文獻報道的較高產酶水平，其FPA、β-葡萄糖苷酶活、木聚糖酶活分別為13.1 IU/g(干曲)、12.2 IU/g(干曲)、994.7 IU/g(干曲)。研究結果初步表明T.koningii QF-02的固態(tài)發(fā)酵工藝是可行的，且纖維素酶系組成更為合理。至于該菌的固態(tài)發(fā)酵工藝與液態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)劣評價目前還無法得出明確的結論，需要從具體的生產條件、生產規(guī)模以及資金與市場因素等多個方面綜合考慮。

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