用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化檸檬苦素閃式提取工藝*

劉靜 劉燦 榮永海 榮龍

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京100191)

檸檬苦素是存在于蕓香科和楝科植物中的三萜類苷元成分，尤其在柑桔屬植物種子中含量豐富［1］.藥理研究表明，檸檬苦素具有抗病毒、抗癌、降低膽固醇等多種生理活性［2-3］.目前關(guān)于檸檬苦素的提取方法主要有索氏提取法［3-5］、超聲波輔助提取法［6］、超臨界 CO2提取法［7］及水助溶劑提取法［8］等.經(jīng)典的索氏提取法耗時較長，一般需要4～8h;超聲波輔助和超臨界CO2法作為新興的提取技術(shù)能顯著縮短提取時間，但由于設(shè)備昂貴、操作條件不易控制而使其工業(yè)化應(yīng)用受到限制;水助溶劑法雖然不使用有機(jī)溶劑，但引入高濃度的助溶劑(Na-Sal或Na-CuS)可能會影響后續(xù)的分離過程.

天然產(chǎn)物有效成分提取工藝的優(yōu)化對提高提取效率和產(chǎn)物收率起著重要作用，目前提取工藝的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法主要有正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法、均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法和響應(yīng)曲面法.經(jīng)典的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在工藝優(yōu)化中已廣泛應(yīng)用;均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)是由方開泰教授和數(shù)學(xué)家王元在1978年共同提出，其應(yīng)用在國內(nèi)外均有報(bào)道［9-10］;響應(yīng)曲面法是通過圖形技術(shù)將響應(yīng)(如提取率)與因素的函數(shù)關(guān)系顯示出來，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于工藝優(yōu)化中.

為了開發(fā)一種快速高效的提取方法，本研究將閃式提取技術(shù)應(yīng)用于檸檬苦素的提取過程中，比較了3種統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化檸檬苦素提取條件的結(jié)果，為統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在天然產(chǎn)物有效成分提取工藝優(yōu)化上的應(yīng)用提供參考.

1 材料和儀器

廣州新會柑脫脂后的種子，廣東省江門市浩倫生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供，種子含油量41.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司生產(chǎn);乙腈為色譜純試劑，北京百靈威科技有限公司生產(chǎn);其他為分析純試劑.

JHBE-50型閃式提取器，河南金鼐科技發(fā)展有限公司生產(chǎn);Waters高效液相色譜儀(600E雙泵，2478型紫外檢測器，Empower色譜工作站)，美國Waters公司生產(chǎn);

2 檸檬苦素提取分離及檢測方法

2.1 閃式提取及分離檸檬苦素

準(zhǔn)確稱取干燥種子粉末10.0 g，置于閃式提取裝置容器中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的具體要求，加入60% ～80%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液 100～300 mL，在3000～5000 r/min轉(zhuǎn)速下提取1 min，提取兩次.將兩次提取液混合，減壓濃縮回收乙醇至干，得到的殘?jiān)由倭渴兔讶コ龤堄嘤椭?，再將殘?jiān)枚燃淄檩腿?，得到的萃取液揮發(fā)至1～3mL，再加入3倍體積的異丙醇，置于4℃條件下結(jié)晶，析出的晶體用異丙醇洗滌，然后加入20 mmol/L的NaOH溶液快速洗滌，最后干燥得到的白色晶體即為檸檬苦素.

2.2 檸檬苦素的液相色譜分析

2.2.1 色譜條件

Waters Sunfire C18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5μm);流動相為45%(體積分?jǐn)?shù))的乙腈溶液;流速為1mL/min;檢測波長為210nm;進(jìn)樣量為20μL;柱溫為室溫.

2.2.2 測定方法

將檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解并用流動相稀釋至不同濃度，以峰面積Y、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X(mg/mL)進(jìn)行線性回歸，得到檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=16671X+35617(r=0.9972)，檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量濃度175～300μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.將2.1節(jié)中獲得的檸檬苦素樣品加入45%的乙腈溶解，配成質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)的溶液，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線中的峰面積計(jì)算出樣品收率(mg/g).

3 結(jié)果與討論

3.1 提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)

本研究選取影響閃式提取工藝的3個因素，各因素及水平變化范圍如下:乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù))60% ～80%，液固比10～30mL/g，閃提轉(zhuǎn)速3000～5000r/min;3個因素依次記為因素A、B、C.根據(jù)不同設(shè)計(jì)方法來選取水平，按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法、均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法和響應(yīng)曲面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

3.1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有“均勻分散、整齊可比”的特點(diǎn)，可定量的給出因素的主次關(guān)系，從而分析各因素對指標(biāo)的影響大小及變化規(guī)律.本研究按照正交表L9(34)進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，各因素水平如表1所示，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果見表3.

由表2直觀分析極差R可以看出，各因素對檸檬苦素收率的影響權(quán)重依次為A＞B＞C.比較k值得出最佳的提取條件是A2B3C2，即乙醇濃度70%、液固比30mL/g，閃提轉(zhuǎn)速4000r/min.由表3的方差分析結(jié)果可以看出，A和B兩個因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P＜0.05)，C因素(P＞0.1)無顯著性影響.對最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到檸檬苦素收率為(6.48±0.01)mg/g.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of experimental conditions for the extraction of limonin by orthogonal design

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of orthogonal design

3.1.2 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法

均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特點(diǎn)不同，它只考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的“均勻分散”，不考慮“整齊可比”，因此能用較少的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)獲得最多的信息.尤其在實(shí)驗(yàn)水平變化范圍較大時，可大大減少實(shí)驗(yàn)次數(shù).如三因素九水平實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要243次實(shí)驗(yàn)，而均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)只需要9次實(shí)驗(yàn)即可完成;若設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，均勻設(shè)計(jì)只需要3次實(shí)驗(yàn)即可完成，但這樣實(shí)驗(yàn)次數(shù)太少，結(jié)果誤差太大，并且對結(jié)果難以進(jìn)行回歸分析.所以本研究選擇與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相同的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，按照均勻表U9(96)進(jìn)行三因素九水平的均勻?qū)嶒?yàn)，各因素水平如表4所示，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示，回歸分析結(jié)果見表6.

表4 均勻?qū)嶒?yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of uniform design

表5 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Optimization of experimental conditions for the extraction of limonin by uniform design

表6 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)回歸分析Table 6 Regression analysis of uniform design

對表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次曲線回歸，方程簡化后為Y=-51.391 9+1.778 1A-0.494 1B-0.0140A2-0.0022B2+0.0089AB，方程相關(guān)系數(shù)r2為0.9628，說明方程擬合較好.由表6可以看出，F(xiàn)值遠(yuǎn)大于Sig.F值，并且Sig.F值＜0.05，說明回歸方程可信且較顯著.方程中去掉了因素C即閃提轉(zhuǎn)速的影響，說明該因素在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對檸檬苦素收率Y的影響很小，這與正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果一致.對回歸方程各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，可知各因素對收率的影響程度依次為A＞B＞C.最佳的提取條件為乙醇濃度72.5%、液固比22.5 mL/g、閃提轉(zhuǎn)速4250r/min，該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到檸檬苦素收率為(6.59±0.01)mg/g.

3.1.3 響應(yīng)曲面法

響應(yīng)曲面法以建立的連續(xù)變量曲面模型對影響提取過程的因素及其交互作用進(jìn)行評價(jià)，來確定最佳水平范圍.本研究采用Box-Behnken Design對檸檬苦素的閃提工藝進(jìn)行優(yōu)化，選擇乙醇濃度、液固比和閃提轉(zhuǎn)速作為自變量，每個自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平編碼分別為-1、0、1.各因素水平編碼如表7所示，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表8所示，方差分析結(jié)果見表9.

表7 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 7 Level and code of variables chosen for Box-Behnken design

表8 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Optimization of experimental conditions for extraction of limonin by Box-Behnken Design

表9 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Analysis of variance(ANOVA)of Box-Behnken design

對表8的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸，得到回歸方程為Y=6.37+0.23A+0.68B+0.24C+0.13AB-0.14AC-0.27BC-1.05A2-0.40B2-0.17C2，可以看出各因素對檸檬苦素收率Y的影響程度依次為A＞B＞C.由表9方差分析可知，該模型的P＜0.01，說明方程非常顯著，而失擬項(xiàng)的P＞0.05，表明其相對于純誤差而言為不顯著.方程相關(guān)系數(shù)r2為0.998，說明方程擬合較好，各因素與收率呈現(xiàn)良好的相關(guān)性.

三維響應(yīng)曲面圖反映了各因素相互作用及對檸檬苦素收率的影響.3個因素對檸檬苦素收率影響的響應(yīng)曲面圖如圖1所示.由圖1可見，乙醇濃度對檸檬苦素收率的影響呈現(xiàn)拋物線趨勢，當(dāng)濃度為72%左右時收率達(dá)到最大值，此后進(jìn)一步增加乙醇濃度，收率降低，這種變化可能是由于種子中的某些蛋白成分在高濃度醇下變性而影響提取效果;圖1中收率隨著液固比的增加而增加，當(dāng)達(dá)到29 mL/g左右時收率不再增加，液固比進(jìn)一步提高后收率基本不變;閃提轉(zhuǎn)速對收率的影響很小，在4 000～4500r/min時收率變化很小，考慮低轉(zhuǎn)速能夠節(jié)約能源，所以選擇閃提轉(zhuǎn)速在4000r/min左右.

對數(shù)據(jù)二次回歸擬合計(jì)算后得出最佳工藝條件為乙醇濃度71.7%、液固比28.8 mL/g、閃提轉(zhuǎn)速3953r/min，通過響應(yīng)曲面法預(yù)測，在最佳條件下檸檬苦素收率可達(dá)6.68mg/g，在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到檸檬苦素收率為(6.65±0.01)mg/g.

3.2 3種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化提取工藝的比較

由前文結(jié)果可以看出，3種優(yōu)化方法得到的最佳提取條件和該條件下得到的檸檬苦素收率結(jié)果相近，其中響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的檸檬苦素收率最高，達(dá)(6.65±0.01)mg/g;可見這3種方法均有較強(qiáng)的優(yōu)化能力，在應(yīng)用方面各有其特點(diǎn).

圖1 3個因素對檸檬苦素收率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plots for the effects of ethanol concentration，solvent/solid ratio and rotational speed on limonin yield

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，數(shù)據(jù)處理方便，通過直觀分析即可得出各因素對收率的影響權(quán)重，但正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)只能對各因素單獨(dú)進(jìn)行考察，對因素間的相互作用很難評價(jià)，并且對收率結(jié)果無預(yù)測能力，這使其應(yīng)用有局限性.當(dāng)實(shí)驗(yàn)因素范圍變化較大，需要較多水平時，均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)則突顯其優(yōu)勢，可極大地減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，但均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析比較復(fù)雜，各因素對收率的影響需通過回歸計(jì)算進(jìn)行分析，由于實(shí)驗(yàn)次數(shù)過少，回歸方程對各因素間的非線性關(guān)系的提取能力較差，故預(yù)測能力太弱.響應(yīng)曲面法建立的是復(fù)雜的多維空間曲面，比較接近實(shí)際情況，由于響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)點(diǎn)安排合理，在保證實(shí)驗(yàn)精度的前提下大大提高了效率，而且預(yù)測能力較強(qiáng)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析同樣需要先對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，才能判斷各因素對檸檬苦素收率的影響程度，并且實(shí)驗(yàn)次數(shù)相對前兩種方法較多，當(dāng)考察因素多、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高時，該法就很難廣泛應(yīng)用.所以針對不同的提取工藝來選取不同的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法是十分必要的.

3.3 檸檬苦素的測定結(jié)果與討論

檸檬苦素純度通過高效液相色譜法測定，檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖2所示.

圖2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.2 HPLC spectra of limonin and the sample from orange seeds

由圖2可見，檸檬苦素樣品的保留時間為7.7min，與標(biāo)準(zhǔn)品一致.樣品純度按下式計(jì)算:

其中:P為檸檬苦素純度，%;ρ為樣品溶液質(zhì)量濃度，g/mL;V為樣品溶液體積，mL;m為樣品質(zhì)量，g.

通過該公式計(jì)算得到檸檬苦素樣品純度為95%.

本研究在檸檬苦素的提取方面采用了先進(jìn)的閃式提取技術(shù)，該技術(shù)依靠高速機(jī)械剪切力和超速動態(tài)分子滲濾作用，在室溫及溶劑存在的條件下，將藥材破碎至細(xì)微顆粒，并使有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡［11］.幾種不同提取方法的提取時間和檸檬苦素收率如表10所示.

由表 10 可見，與其他提取方法相比［5，7-8］，閃式提取法得到了高純度高收率的檸檬苦素，雖然超臨界CO2法得到的收率與其相當(dāng)，但閃式提取時間大大降低，所以該技術(shù)在檸檬苦素提取方面具有效率高、耗時少、能耗低的特點(diǎn)，可進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中.

表10 不同提取方法的提取時間和檸檬苦素收率Table 10 Extraction time and limonin yields with different extraction methods

4 結(jié)語

通過3種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法、均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法和響應(yīng)曲面法)分別優(yōu)化了閃式提取廣州新會柑種子中檸檬苦素的提取工藝，并通過結(jié)晶法對產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，采用高效液相色譜法對產(chǎn)物進(jìn)行測定，得到檸檬苦素純度為95%;其中響應(yīng)曲面法最佳提取條件(乙醇濃度71.7%，液固比28.8mL/g，閃提轉(zhuǎn)速3953 r/min)下，檸檬苦素收率達(dá)(6.65±0.01)mg/g，略高于其他兩種優(yōu)化方法結(jié)果.總的來看，這3種優(yōu)化方法結(jié)果相近，結(jié)論基本一致.本研究對閃式提取技術(shù)的開發(fā)和優(yōu)化提取工藝的方法具有重要的參考價(jià)值.

［1］Manners G D.Citrus limonoids:analysis，bioactivity，and biomedical prospects［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(21):8285-8294.

［2］El-Readi M Z，Hamdan D，F(xiàn)arrag N，et al.Inhibition of P-glycoprotein activity by limonin and other secondary metabolites from Citrus species in human colon and leukaemia cell lines ［J］.European Journal of Pharmacology，2010，626(2/3):139-145.

［3］Mandadi K，Ramirez M，Jayaprakasha G K，et al.Citrus bioactive compounds improve bone quality and plasma antioxidant activity in orchidectomized rats［J］.Phytomedicine，2009，16(6/7):513-520.

［4］Vikram A，Jayaprakasha G，Patil B.Simultaneous determination of citrus limonoid aglycones and glucosides by high performance liquid chromatography［J］.Analytica Chimica Acta，2007，590(2):180-186.

［5］Patil J R，Jayaprakasha G K，Murthy K N C，et al.Characterization of Citrus aurantifolia bioactive compounds and their inhibition of human pancreatic cancer cells through apoptosis［J］.Microchemical Journal，2010，94(2):108-117.

［6］張朝暉，朱中品，李輝.柑橘中檸檬苦素超聲提取工藝及含量分析 ［J］.食品科學(xué)，2009，30(8):56-59.Zhang Zhao-hui，Zhu Zhong-pin，Li Hui.Study on ultrasonic-assisted extraction of limonin from Xiangxi Ponkan Peel and analysis of limonin content in Ponkan at different growth periods and peel and seed of different citrus varieties［J］.Food Science，2009，30(8):56-59.

［7］Yu J，Dandekar D V，Toledo R T，et al.Supercritical fluid extraction of limonoids and naringin from grapefruit(Citrus paradisiMacf.)seeds ［J］.Food Chemistry，2007，105(3):1026-1031.

［8］Dandekar D V，Jayaprakasha G K，Patil B S.Hydrotropic extraction of bioactive limonin from sour orange(Citrus aurantiumL.)seeds ［J］.Food Chemistry，2008，109(3):515-520.

［9］姚鐘堯，梁士慧.均勻設(shè)計(jì)法在丁苯橡膠配方試驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2001，29(1):78-82.Yao Zhong-yao，Liang Shi-hui.Application of the uniform design method in SBR formula test［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2001，29(1):78-82.

［10］Li J，Liao H，Ding C，et al.Optimizing the plasma spray process parameters of yttria stabilized zirconia coatings using a uniform design of experiments［J］.Journal of Materials Processing Technology，2005，160(1):34-42.

［11］劉靜，榮永海，王志濱，等.羅漢果有效成分的連續(xù)提取與分離［J］.中藥材，2010，33(4):629-632.Liu Jing，Rong Yong-hai，Wang Zhi-bin，et al.Cascade extraction and separation of the active constituents of Siraitia grosvenorii［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2010，33(4):629-632.