二氫楊梅素對乳腺癌荷瘤小鼠化療的增效減毒作用*

周防震 黃敏 張曉元 郭勇

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006;2.廣州軍區(qū)機關門診部，廣東廣州510080;3.華南理工大學工業(yè)技術研究總院，廣東廣州510640)

惡性腫瘤患者大多數(shù)均需進行化療，但化療藥物在殺傷或殺死腫瘤細胞的同時，對體內(nèi)正常的組織細胞也具有明顯的損傷作用.機體過量產(chǎn)生的活性氧被認為是化療藥物毒副作用的根源［1-3］.文獻資料顯示聯(lián)合化療藥物和具有抗氧化活性的化學預防試劑可以增加化療試劑的抗腫瘤作用，降低化療藥物誘導的毒副作用［4］.

二氫楊梅素(DMY)化學名為 3，5，7，3＇4＇5＇-六羥基-2，3雙氫黃酮醇，是從藤茶(Ampelopsis grossedentata)等植物莖葉中提取的一種二氫黃酮醇化合物.研究表明DMY具有抗氧化、保肝護肝、降血糖、增強人體免疫力等多種生理活性［5］.阿霉素(ADM)作為一種周期非特異性廣譜抗癌藥物，對多種腫瘤有明顯療效，已廣泛應用到乳腺癌的臨床化療中，但其與劑量依賴性相關的心肌毒性、骨髓抑制和肝毒性等副作用限制了它的臨床使用［6-7］.前期實驗表明，離體條件下DMY能增加乳腺癌細胞對ADM的敏感性，表現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用［8］，但關于其在腫瘤化療中的增效減毒作用未見報道.文中通過建立4T1乳腺癌細胞Balb/C小鼠體內(nèi)移植腫瘤模型，探討DMY與ADM聯(lián)合應用時的體內(nèi)抗腫瘤作用，以期為DMY作為化療輔助藥物的開發(fā)和利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和瘤株

SPF級Balb/C小鼠36只，雌性，體重13～15g，購于廣東省實驗動物中心，合格證編號為0076054.實驗前適應性馴養(yǎng)1周.飼料和墊料均購于廣東省實驗動物中心.實驗期間自由采食飲水.小鼠乳腺癌4T1瘤株由暨南大學生物工程研究所提供.

1.1.2 藥物

DMY從藤茶(A.grossedentata)中以水提醇沉和重結晶方法分離純化，并通過高效液相色譜、紫外光譜、紅外光譜和質(zhì)譜等檢測和鑒定，純度為96%.注射用鹽酸阿霉素(ADM)由浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn).

1.2 方法

1.2.1 腫瘤模型的建立

參照孫鳳梅［9］的方法建立乳腺癌荷瘤小鼠模型.以胰酶消化方式收集對數(shù)生長期4T1細胞，利用臺盼藍計數(shù)細胞，14℃、800r/min離心5min，除去上清液，將細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，調(diào)整細胞密度為1×104個/μL，小鼠麻醉后，每只小鼠于右后腿皮下注射50μL細胞懸液.

1.2.2 動物分組

接種次日開始進行藥物干預.小鼠隨機分成4組，每組9只.分組如下:對照組(生理鹽水溶液處理)、2mg/(kg·d)ADM 組、100mg/(kg·d)DMY 組以及聯(lián)合用藥(100mg/(kg·d)DMY+2 mg/(kg·d)ADM)組.

1.2.3 抑瘤率和肺轉移灶數(shù)的計算

DMY采用灌胃給藥的方式，每天固定時間給藥，連續(xù)給藥27 d.ADM采用腹腔注射(ip)，給藥3d、停藥3 d為一個周期.每天測量小鼠體重，第5個周期的第4天取血后處死動物.剝離腫瘤并稱重，計算抑瘤率［10］.解剖取出小鼠肺臟，以冰冷的PBS清洗后，以4%的多聚甲醛固定過夜，Leika雙目解剖鏡8倍下計數(shù)小鼠肺臟(共5葉)表面轉移群落的數(shù)量.

1.2.4 心肝功能的血清檢測

眼球采血后離心，取上清.利用全自動生化分析儀測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)水平.

1.2.5 統(tǒng)計方法

2 結果與分析

2.1 DMY對小鼠瘤重及抑瘤率的影響

各組實驗鼠給藥27 d后處死，剝離腫瘤，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤呈灰白色，浸潤，質(zhì)硬.各藥物均能一定程度抑制瘤體的增長，單獨使用2 mg/(kg·d)ADM能顯著減少瘤重(P＜0.05)，100 mg/(kg·d)DMY組小鼠的瘤重相比對照組無顯著差異，100mg/(kg·d)DMY與2 mg/(kg·d)ADM聯(lián)合用藥組小鼠瘤重顯著小于對照組(P＜0.01)，2 mg/(kg·d)ADM、100 mg/(kg· d)DMY、2 mg/(kg· d)ADM+100mg/(kg·d)DMY組的抑瘤率分別為28.44%、11.84%和46.92%(見表1).

2.2 DMY對小鼠乳腺癌肺轉移的影響

藥物干預下荷瘤小鼠肺部轉移灶數(shù)如圖1所示.從圖1可以看出:各藥物處理組小鼠肺部轉移灶數(shù)顯著低于對照組(P＜0.01);2 mg/(kg·d)ADM組小鼠肺部轉移灶數(shù)小于100 mg/(kg·d)DMY組，但無顯著差異;而100 mg/(kg·d)DMY聯(lián)合2mg/(kg·d)ADM組小鼠肺部轉移灶數(shù)顯著小于2mg/(kg·d)ADM組(P＜0.05).

圖1 藥物干預下荷瘤小鼠肺部轉移灶數(shù)Fig.1 Lung metastatic loci in tumor-bearing mice treated with drug intervention

2.3 DMY對化療荷瘤小鼠心臟毒性的影響

各組實驗鼠給藥27 d后的血清生化分析表明，100mg/(kg·d)DMY組小鼠的LDH水平顯著低于對照組(P＜0.05)，而2mg/(kg·d)ADM處理能顯著增加血清中LDH的含量(P＜0.01)，100mg/(kg·d)DMY聯(lián)合2 mg/(kg·d)ADM處理能顯著降低ADM誘導的LDH的增加量(P＜0.05)，但相對于對照組并無顯著差異(見圖2).

圖2 藥物干預下荷瘤小鼠的血清LDH水平Fig.2 Serum LDH level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

圖3顯示了單獨使用2 mg/(kg·d)ADM或100mg/(kg·d)DMY處理的結果，發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠血清的CK水平雖有變化但并無統(tǒng)計學上的顯著差異，而二者聯(lián)合使用可以顯著降低血清CK水平(P＜0.05).

圖3 藥物干預下荷瘤小鼠的血清CK水平Fig.3 Serum CK level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

2.4 DMY對化療荷瘤小鼠肝毒性的影響

藥物干預下荷瘤小鼠的血清ALT水平如圖4所示.從圖4中可以看出，單獨使用2 mg/(kg·d)ADM或100mg/(kg·d)DMY，或者二者聯(lián)合使用時，荷瘤小鼠血清的ALT水平相對于對照組并無明顯差異，但聯(lián)合使用 2 mg/(kg·d)ADM和100mg/(kg·d)DMY的處理組荷瘤小鼠血清的ALT水平低于單獨使用2mg/(kg·d)ADM的處理組(P=0.058).

圖4 藥物干預下荷瘤小鼠的血清ALT水平Fig.4 Serum ALT level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

藥物干預下荷瘤小鼠的血清AST水平如圖5所示.統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，單獨使用2 mg/(kg·d)ADM的處理組荷瘤小鼠血清中的AST水平顯著高于對照組(P＜0.05)，而單獨使用100 mg/(kg·d)DMY的處理組以及聯(lián)合用藥組荷瘤小鼠血清的AST水平相對于對照組無顯著變化.

圖5 藥物干預下荷瘤小鼠的血清AST水平Fig.5 Serum AST level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

3 討論

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，DMY+ADM聯(lián)合用藥組的小鼠毛色相對于單獨ADM組更具光澤，且ADM停藥期，聯(lián)合用藥組的小鼠進食情況明顯優(yōu)于單獨ADM用藥組.由于血清中LDH、CK和ALT、AST水平分別是反應心肌細胞和肝細胞損傷的重要指標，實驗結果表明DMY能減輕ADM引起的心肝毒性，對小鼠心肌細胞和肝細胞具有一定的保護作用.蘇東林等［11］的研究也發(fā)現(xiàn)DMY對酒精性肝損傷具有保護作用，但DMY對ADM引起的心臟毒性的保護作用尚屬首次報道.

ADM是細胞周期非特異性藥物，主要通過將腫瘤細胞阻滯于G2/M期而發(fā)揮其直接殺傷作用［12］.作用機理不同的藥物聯(lián)合使用可能通過互補作用增強了抗腫瘤效果［13］，DMY對ADM的增效作用可能與DMY的抗腫瘤機制有關.DMY具有很強的抗氧化作用［14-15］，研究中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組小鼠的脾臟指數(shù)大于單獨ADM用藥組，表明DMY減輕ADM心肝毒性的機制可能與其抗氧化作用有關.鄭宏強、劉德育等［16-17］的研究也發(fā)現(xiàn)濃度小于100 μmol/L的DMY(相當于32mg/L)不僅對黑色素瘤B16細胞不產(chǎn)生毒性作用，還能明顯抑制B16細胞的侵襲、運動和粘附.由本研究可以看出，與對照組相比，100mg/(kg·d)DMY能顯著減少荷瘤小鼠腫瘤肺部轉移灶數(shù)和瘤重，暗示抑制腫瘤轉移可能是DMY的主要抗腫瘤作用機制.

4 結語

文中探討了DMY對乳腺癌荷瘤小鼠化療的增效減毒作用，結果顯示，100mg/(kg·d)DMY聯(lián)合2mg/(kg·d)ADM處理能明顯提高ADM對Balb/C小鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤率，減少腫瘤肺轉移灶數(shù)，從而顯著增加ADM化療的抗腫瘤效果.血清生化分析顯示DMY與ADM聯(lián)合使用可減少ADM單獨使用所造成的血清LDH、ALT和AST水平的增加量，表明DMY能降低ADM引起的心、肝毒性反應.DMY對荷瘤小鼠ADM化療的增效和減毒作用拓展了DMY的新應用，為將其開發(fā)為化療藥物的輔助藥物提供了參考，但其具體機制尚需進一步研究.

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