心肌營(yíng)養(yǎng)素1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞*

彭朝權(quán)， 高 雅， 項(xiàng) 鵬， 楊 珂， 鄒麗媛， 吳 曉

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究中心，廣東 廣州 510080)

缺血性心臟病是全球高發(fā)的疾病之一，其本質(zhì)是心肌細(xì)胞的不可逆喪失。目前臨床積極進(jìn)行溶栓、介入等再灌注治療，但仍缺乏針對(duì)已經(jīng)梗死心肌細(xì)胞再生的根本性治療方法，梗死心肌形成無(wú)收縮功能的瘢痕組織，導(dǎo)致心功能改變，最終導(dǎo)致心衰。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為心肌細(xì)胞的再生帶來(lái)了新的希望，其中，成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)易于獲取、擴(kuò)增，具有多分化潛能，且免疫源性較低［1］，甚至具有免疫抑制作用［2］，是心肌細(xì)胞再生有前途的種子細(xì)胞。近年來(lái)，以5－氮雜胞苷(5－azacytidine，5－Aza)為先驅(qū)和代表，將MSCs誘導(dǎo)分化為有功能、乃至有電活動(dòng)的心肌細(xì)胞的研究始終在進(jìn)行［3］。新的誘導(dǎo)劑大致分為如下幾類:(1)細(xì)胞因子類，如血管內(nèi)皮生成因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等;(2)炎癥因子類如白細(xì)胞介素－6，腎素、血管緊張素－Ⅰ、血管緊張素－Ⅱ等;(3)中醫(yī)藥類如黃芪甲甙、雙地龍、丹參酚酮、淫羊藿等。

心肌營(yíng)養(yǎng)素1(cardiotrophin 1，CT－1)是白細(xì)胞介素－6細(xì)胞因子家族的一員，最早發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)細(xì)胞肥大的作用，在先天性心臟病、心肌病、進(jìn)行性心力衰竭和心肌梗死等病理過程中均有過度表達(dá)。而CT－1誘導(dǎo)大鼠MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究亦在進(jìn)行［4］，其結(jié)果提示:CT－1可輔助5－Aza提高誘導(dǎo)率，但未能獨(dú)立將MSCs誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞。因此，本研究將探討CT－1在MSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞中的作用，明確其誘導(dǎo)功效。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 小型豬1頭，6月齡，體重26 kg，雌性，南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證明編號(hào)No.0038589)。

1.2 主要器材 超凈工作臺(tái)，調(diào)溫低速離心機(jī)(Eppendorf)，微型高速離心機(jī)(Eppendorf)，Shel Lab 2323－2 CO2孵箱(Shel Lab)，倒置顯微鏡(Olympus)，電子天平，恒溫水浴箱(Shel Lab)，純水儀，搖床，骨髓穿刺包等。

1.3 主要試劑 CT－1(Invitrogen)，5－Aza(Sigma)，1073 g/L Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液(Pharmacia)，鼠抗豬α－actin單克隆抗體(Santa Cruz)，羊抗豬心肌特異性肌鈣蛋白T(cardiac specific troponin T，cTnT)多克隆抗體(Abcam)，TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(Protein Tech Group)，Hoechst染色液，DMEM－F12培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，肝素鈉注射液，Triton X－100，速眠新及4%多聚甲醛等。

2 方法

2.1 原代骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增 全麻后，穿刺小型豬髂后上棘多點(diǎn)吸取約40－50 mL骨髓液(等量 PBS稀釋，肝素抗凝);加入 Ficoll液，2000 r/min離心20 min;吸取白膜層，加入等量PBS，1100 r/min離心4 min;去上清，加入用含 10%FBS的L－DMEM培養(yǎng)基重懸，按(2－3)×105/cm2的濃度接種于6孔板，置37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞80% －90%融合時(shí)，0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代擴(kuò)增至第4－6代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MSCs，消化離心，按1×107/L接種于24孔板，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。加入DMSO 250 μL，振蕩10 min。

2.2 MSCs分化能力的鑒定

①成骨誘導(dǎo) 將細(xì)胞按2×104/cm2密度接種于6孔板，生長(zhǎng)至80%時(shí)，加成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，約12 d可見細(xì)胞聚集為鈣化結(jié)節(jié)，逐漸增多增大，21 d后鈣化結(jié)節(jié)行茜素紅染色。

②成脂誘導(dǎo) 將細(xì)胞按2×104/cm2密度接種于6孔板，生長(zhǎng)至80%時(shí)，加成脂誘導(dǎo)液A誘導(dǎo)，3 d后換液并再予成脂B液誘導(dǎo)，如此循環(huán)約至14 d行油紅O染色。

2.3 多組誘導(dǎo)分化 將MSCs均勻接種于12孔板，每張板上分為4組，每組共3孔，組內(nèi)處理方法相同，A:空白對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基);B:5－Aza組(含10 μmol/L 5－Aza的無(wú)血清培養(yǎng)基);C:CT－1組(含0.1 μg/L CT－1的無(wú)血清培養(yǎng)基);D:合用組(10 μmol/L 5 －Aza+0.1 μg/L CT －1 的無(wú)血清培養(yǎng)基)。當(dāng)細(xì)胞增殖至每孔面積的80%時(shí)，加入上述濃度誘導(dǎo)液作用24 h，用原10%胎牛血清培養(yǎng)基的L－DMEM換液，于 37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，不加任何干擾因素，隔3 d換液，觀察細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光檢測(cè)以及計(jì)算細(xì)胞熒光陽(yáng)性率:取誘導(dǎo)后28 d的細(xì)胞行α－actin和cTnT免疫熒光染色，并計(jì)數(shù)誘導(dǎo)后28 d各組細(xì)胞的陽(yáng)性染色率。(1)0.01 mol/L PBS洗滌;(2)4%多聚甲醛固定，0.01 mol/L PBS洗滌;(3)0.2%Triton X－100穿透半小時(shí)，0.01 mol/L PBS洗滌;(4)滴加10%正常山羊血清封閉細(xì)胞;(5)棄血清后分別加入Ⅰ抗α－actin，cTnT(0.01 mol/L PBS 1∶200稀釋)，陰性對(duì)照組用0.01 mol/L PBS替代;(6)濕盒中保存，4℃過夜;(7)予0.01 mol/L PBS洗滌;(8)在避光條件下加入TRITC結(jié)合1 h，予0.01 mol/L PBS洗滌;(9)Hoechst染色法染細(xì)胞核10 min，予0.01 mol/L PBS洗滌;(10)熒光顯微鏡下觀察，分別觀測(cè)藍(lán)色、紅色熒光。計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)(N)和紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(Ni);計(jì)算MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率(Ni/N×100%)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

結(jié) 果

1 西藏小型豬MSCs的培養(yǎng)情況

接種到6孔板的原代細(xì)胞，被大量紅細(xì)胞覆蓋，24 h后首次換液，隱約可見孔底少量貼壁細(xì)胞，1周可見多個(gè)長(zhǎng)梭形細(xì)胞集落，見圖1A，核圓居中，含1－3個(gè)核仁。約12 d首次按2×104/cm2密度傳代，細(xì)胞貼壁后形態(tài)如前，約9－12 d密集生長(zhǎng)至80%－90%，見圖1B，傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

Figure 1.Morphology of the MSCs under an inverted microscope(×100).A:6 d after inoculation，spindle－shaped cells were observed;B:12 d after inoculation，MSCs reached 80% －90%.圖1 相差顯微鏡下MSCs形態(tài)學(xué)觀察

取第4代細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)，約12 d可見細(xì)胞聚集為鈣化結(jié)節(jié)，逐漸增多增大，21 d后鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性，見圖2A。進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，7 d后，細(xì)胞已由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切?，?xì)胞體積逐漸增大，胞質(zhì)內(nèi)有圓球形半透明脂滴形成，部分細(xì)胞胞核擠向一側(cè)，第14 d行油紅O染色，胞核周圍紅染，見圖2B。

Figure 2.Osteogenic and adipogenic differentiation.A:alizarin red staining for osteogenesis on day 21，showing orange－red calcium nodules(×200);B:oil red O staining for adipogenesis on day 14(×400).These results indicate that MSCs are multipotent.圖2 MSCs成骨成脂分化結(jié)果

2 MSCs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后第14 d起，可見除空白對(duì)照組外，各組均有部分細(xì)胞形態(tài)變寬，體積逐漸增大，約21 d起，可見細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，細(xì)胞回縮變短，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)，細(xì)胞排列具有明顯的方向性，具有短棒狀結(jié)構(gòu)及位于中心的細(xì)胞核，核/漿比例明顯降低，見圖3。培養(yǎng)至28 d，上述傾向仍明顯，但各組均有部分細(xì)胞形態(tài)漸趨扁平，胞核扁圓，出現(xiàn)空泡，并有少量細(xì)胞失去規(guī)則形態(tài)，核仁消失，細(xì)胞死亡。

Figure 3.Morphology of MSCs 28 d after induction with 5－Aza(×100).圖3 5－Aza誘導(dǎo)后28 d光鏡下觀察

3 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

按每組1個(gè)孔選3個(gè)400倍視野計(jì)數(shù)3次，取Hoechst法藍(lán)染的細(xì)胞核數(shù)為MSCs細(xì)胞總數(shù)，取明亮以及可見紅色熒光的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。在熒光顯微鏡下，分別觀察各組藍(lán)色、紅色熒光的表達(dá)，并合成于同一幅圖片中，記錄其紅色熒光表達(dá)率。免疫熒光染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組可見極少量紅色熒光光點(diǎn)，略呈圓形，形狀較正常MSCs小，有些周圍未見顯示藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，提示可能為雜質(zhì)所導(dǎo)致的假陽(yáng)性，見圖4A、E。CT－1組、5－Aza組和合用組均可見部分細(xì)胞顯示紅色熒光，與顯示藍(lán)色熒光的細(xì)胞核重合。其中，合用組紅色熒光細(xì)胞數(shù)最多，見圖4B、C、D、F、G、H。其中 CT －1 組具有較典型的紅色熒光細(xì)胞的表達(dá)。

Figure 4.Immunofluorescence staining results in each group(×100).A:Hoechst nuclear dye in control group;B:Hoechst nuclear dye in CT－1 group;C:Hoechst nuclear dye in 5－Aza group;D:Hoechst nuclear dye in CT－1 and 5－Aza group;E:red fluorescence in control group;F:red fluorescence in CT－1 group;G:red fluorescence in 5－Aza group;H:Red fluorescence in CT－1 and 5－Aza group.圖4 各組細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果

4 各組分化為心肌細(xì)胞陽(yáng)性率比較

由圖5可見，合用組的誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞αactin陽(yáng)性率為29.90% ±4.76%，明顯大于5－Aza組(17.73% ±2.35%，P＜0.01)、CT－1組(6.63%±0.55%，P＜0.01)和空白對(duì)照組(1.62% ±0.09%，P＜0.01);5－Aza組明顯大于CT－1組(P＜0.01)和空白對(duì)照組(P＜0.01);CT－1組明顯大于空白對(duì)照組(P＜0.05)。

cTnT紅色熒光染色結(jié)果顯示，合用組的誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞cTnT陽(yáng)性率為36.50% ±4.09%，明顯大于5－Aza組(14.37% ±1.65%，P＜0.01)、CT－1組(7.50% ±0.61%，P＜0.01)和空白對(duì)照組(1.12% ±0.23%，P＜0.01);5－Aza組明顯大于CT－1組(P＜0.01)和空白對(duì)照組(P＜0.01);CT－1組明顯大于空白對(duì)照組(P＜0.01)。

討 論

Figure 5.The percentage of positive expression of α － actin and cTnT in each group..n=3.＊＊P＜0.01 vs contnol;##P＜0.01 vs CT－1 or 5－Aaz group.圖5 各組誘導(dǎo)分化細(xì)胞α－actin和cTnT陽(yáng)性表達(dá)率

干細(xì)胞和前體細(xì)胞再生潛能的發(fā)現(xiàn)為從根本上治療心肌梗死和預(yù)防心梗后心衰提供了可能性，因此心肌細(xì)胞再生的實(shí)驗(yàn)研究與臨床探索均在蓬勃開展［5］。MSCs易于獲取、分離、擴(kuò)增，以及弱的免疫抗原性，尤其是易于外源基因的導(dǎo)入［6］，且可保持其未分化特性，為作為基因載體治療遺傳缺陷性疾病奠定了基礎(chǔ)。要提高M(jìn)SCs的療效，經(jīng)基因修飾過度表達(dá)血管生成因子［7］、生長(zhǎng)因子或干細(xì)胞歸巢因子等細(xì)胞因子作為旁分泌因子均為目前的研究熱點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過修飾的MSCs治療急性心肌梗死，比單純的細(xì)胞治療組和基因治療組能更好地改善心肌灌注、修復(fù)心臟功能［8］。另外，由于豬的心臟功能與結(jié)構(gòu)均與人類相似度最高，是最常用的大型動(dòng)物。因此，本課題選擇西藏小型豬MSCs為研究對(duì)象，為進(jìn)一步的在體實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。此外，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞活力觀察，表明我們分離到的西藏小型豬MSCs的存活能力很強(qiáng)，細(xì)胞穩(wěn)定，存活率高，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好。而對(duì)其分化潛能的測(cè)定方面，成骨與成脂均獲得較好的誘導(dǎo)效果，提示其具有良好的分化潛能。

CT－1是IL－6細(xì)胞因子家族的一員，能促使體外心肌細(xì)胞肥大，遂命名為心肌營(yíng)養(yǎng)素 1［9］。在1995年研究高血壓心肌細(xì)胞肥大時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)［10］，后來(lái)CT－1又被發(fā)現(xiàn)在多種心臟病理過程中，均有過度表達(dá)，乃至于一段時(shí)間內(nèi)被作為心血管疾病生物標(biāo)記物被研究，進(jìn)一步研究提示其水平的升高或許是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，在對(duì)保持心臟正常功能及心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展方面有重要意義［11］。gp130是IL－6細(xì)胞因子家族共有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，為I型膜蛋白分子，由3部分組成:與配體結(jié)合的胞外區(qū)、有激酶活性的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)。gp130蛋白含918個(gè)氨基酸，其中信號(hào)肽和跨膜區(qū)各22個(gè)殘基，胞外區(qū)和胞漿區(qū)分別含597和277個(gè)殘基［12］。在心肌細(xì)胞，CT－1通過2條途徑起作用:一條是通過激活蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(JAK/STAT3)途徑引起心肌肥大和保護(hù)心?。?，12］。CT－1先與心肌細(xì)胞上的跨膜受體gp130/LIFR結(jié)合，gp130和白血病抑制因子受體β亞基酪氨酸磷酸化，促進(jìn)二聚體，并與其特異性α受體結(jié)合，從而激活與受體相連的JAK1、JAK2和Tyk2等，并使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活物3(STAT3)酪氨酸磷酸化形成二聚體，再轉(zhuǎn)位至核內(nèi)與靶基因增強(qiáng)子元件結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一系列與心肌肥厚有關(guān)的效應(yīng)。Liao等［13］的研究亦表明，在心肌缺血－再灌注后注射CT－1能明顯對(duì)抗心肌缺血引起的損傷，這種保護(hù)作用通過蘇氨酸磷酸化激活蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(MAPK通路)的抑制而被拮抗，應(yīng)用的MAPK特異性抑制劑PD98059能夠阻止MAPK的激活，阻斷CT－1促進(jìn)心肌細(xì)胞生存的作用，導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失。而有研究認(rèn)為，MAPK途徑與分化終末的細(xì)胞存活有關(guān)［14］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MAPK通路受抑制的同時(shí)，STAT3過度表達(dá)所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、部分mRNA的表達(dá)以及蛋白的合成也被抑制，說(shuō)明這2條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌細(xì)胞肥大中發(fā)生了“交叉對(duì)話”，互相影響，互相聯(lián)系，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，進(jìn)而表現(xiàn)為CT－1的多種生物學(xué)功能［15］。

Makino等［3］將從小鼠骨髓中分離出的MSCs連續(xù)傳代，得到永生型細(xì)胞，在5－Aza的作用下誘導(dǎo)分化，1周后觀察到約30%MSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積變大，向同一方向延展成棒狀，2周后與周圍細(xì)胞相連。3周后通過閏盤與相鄰細(xì)胞連接，形成微管樣結(jié)構(gòu)。此后國(guó)內(nèi)外多次報(bào)道并證實(shí)相關(guān)結(jié)論。從而為MSCs誘導(dǎo)分化成為心肌細(xì)胞用于細(xì)胞移植與基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但上述相關(guān)報(bào)道的動(dòng)物模型多為以嚙齒類動(dòng)物如大鼠、小鼠。

關(guān)于大型動(dòng)物模型西藏小型豬MSCs經(jīng)5－Aza誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的報(bào)道尚不多見。因此本課題選擇5－Aza作為陽(yáng)性對(duì)照的誘導(dǎo)劑，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中嘗試了從2.5 μmol/L到20 μmol/L等多種濃度，驗(yàn)證10 μmol/L的誘導(dǎo)濃度下，細(xì)胞的形態(tài)變化較明顯，且細(xì)胞毒性較小;而當(dāng)濃度為15 μmol/L及以上時(shí)，加入誘導(dǎo)劑24 h內(nèi)，部分細(xì)胞即出現(xiàn)皺縮，喪失貼壁狀態(tài)，聚集成團(tuán)脫落。因此實(shí)驗(yàn)組均選擇10 μmol/L的誘導(dǎo)濃度。本課題的結(jié)果證實(shí)了5－Aza對(duì)于西藏小型豬MSCs的誘導(dǎo)分化能力。另外，亦有研究表明:部分未經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的MSCs經(jīng)長(zhǎng)期傳代后，持續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至融合時(shí)亦可出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu)，因而認(rèn)為MSCs具有長(zhǎng)期傳代增殖后，可自發(fā)出現(xiàn)肌源性轉(zhuǎn)化的生物學(xué)生長(zhǎng)特性，而非必然是誘導(dǎo)的結(jié)果［16］。因此本課題在設(shè)置空白對(duì)照組的同時(shí)，亦設(shè)置了相應(yīng)的陰性對(duì)照組，并選擇了第6代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組的誘導(dǎo)陽(yáng)性率與陰性對(duì)照組的誘導(dǎo)陽(yáng)性率相比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明第6代MSCs持續(xù)培養(yǎng)28 d時(shí)，未出現(xiàn)明顯的自發(fā)性肌源性轉(zhuǎn)化。而5－Aza組的MSCs出現(xiàn)了部分細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異性抗原，說(shuō)明5－Aza能夠?qū)⑿⌒拓iMSCs誘導(dǎo)成為心肌樣細(xì)胞。但是，對(duì)于所謂“心肌樣細(xì)胞”的認(rèn)定，如有條件，可行電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究細(xì)胞表達(dá)的情況，并研究細(xì)胞的電生理活動(dòng)情況及細(xì)胞之間的聯(lián)系。

本課題選擇CT－1作為一種有前途的誘導(dǎo)劑進(jìn)行研究，并以5－Aza作為陽(yáng)性對(duì)照，研究CT－1誘導(dǎo)西藏小型豬MSCs分化為心肌樣細(xì)胞中的作用。CT－1說(shuō)明書中以0.1 μg/L作為其毒性作用濃度的上限，因此在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)置了0.1 μg/L、0.05 μg/L、0.025 μg/L濃度組。在誘導(dǎo)作用1 d后，各組均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞中毒及死亡情況。在連續(xù)培養(yǎng)28 d后，各組死亡及狀態(tài)差的比例未觀察到明顯的差異。因此，在正式實(shí)驗(yàn)中，確定0.1 μg/L作為誘導(dǎo)濃度。在最終的誘導(dǎo)結(jié)果中，CT－1組的誘導(dǎo)率與空白對(duì)照組有顯著差異，證實(shí)了0.1 μg/L的CT－1能夠單獨(dú)在體外誘導(dǎo)西藏小型豬MSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞獲得部分心肌細(xì)胞特異性蛋白(α－actin、cTnT)的表達(dá)。而在合用組中，CT－1(0.1 μg/L)與 5 － Aza(10 μmol/L)合用能夠顯著提高西藏小型豬MSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)率。CT－1能夠?qū)⑽鞑匦⌒拓iMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，其誘導(dǎo)率高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，但低于5－Aza組(P＜0.01);而CT－1與5－Aza的合用誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化的效率與單獨(dú)的5－Aza組比較，效率顯著提高，其差異顯著(P＜0.01)。因此我們認(rèn)為CT－1和5－Aza均可以誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，這為下一步用CT－1修飾MSCs移植治療急性心肌梗死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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