N-乙酰半胱氨酸對成年大鼠高氧肺損傷氧化應激機制的影響

劉慶輝，安 莉，石 敏，劉 巖，俞森洋 （解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京 100853）

急性缺氧性呼吸衰竭常需高濃度氧療，但高濃度氧療在改善機體供氧的同時也會引起肺結構和功能的異常，即高氧肺損傷[1]。高氧暴露可直接刺激活性氧種類（reactive oxygen species, ROS）的生成并導致細胞活性的改變，造成肺泡上皮細胞、毛細血管內皮細胞結構和功能損害，從而導致嚴重的肺損傷，可見氧化應激反應是高氧肺損傷重要機制之一[2]。目前對新生或幼年動物的高氧肺損傷研究較多，而對成年動物的相關研究較為少見[3]。本研究探討了成年大鼠高氧肺損傷發(fā)生的氧化應激機制，并觀察了臨床常用藥物N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）預處理的影響，為探索防治高氧肺損傷的藥物提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

成年健康雄性清潔級SD大鼠48只（軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供），體重（302.2±12.8） g。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 48只大鼠隨機分為6組，每組8只。5組置入動物實驗氧艙（中國煙臺東科高壓氧設備有限公司）中吸入100%濃度氧氣，吸氧時間為24 h、48 h、72 h、96 h、96 h，作為24 h、48 h、72 h、96 h組和NAC干預組，并分別于0 h、24 h、48 h、72 h腹腔內注射NAC（200 mg·kg-1）預處理。還有1組吸入空氣0 h作為0 h組。

1.2.2 標本收集 到達實驗終點后，將大鼠移出氧艙，分離右側頸總動脈并抽取動脈血。取出完整肺臟，稱取全肺濕重。取右肺組織一小塊用4%多聚甲醛溶液固定，剩余右肺組織立即放入凍存管，并置于液氮生物容器保存。肺組織勻漿制備：按每100 mg肺組織加入0.9 mL PBS（pH 7.4）的比例，冰浴下制成10%勻漿，3000 轉·min-1離心20 min，取上清液－20 ℃凍存。

1.2.3 觀察指標 根據(jù)動脈血氣分析結果計算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2），測定肺系數(shù)評價肺水腫的程度。肺組織及血清中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）活性測定采用相應的試劑盒。觀察肺臟組織病理學變化。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用chiss統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，所測數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

24 h、48 h組大鼠呼吸較為平穩(wěn)，口鼻紅潤；72 h組大鼠呼吸頻率增快，活動減少；96 h組明顯呼吸窘迫，口唇紫紺明顯。同96 h組相比，NAC干預組大鼠呼吸困難程度明顯減輕，口唇僅有輕度紫紺。

2.2 氧合指數(shù)

0 h組、24 h組、48 h組的氧合指數(shù)分別為（452.98±8.10）、（453.23±10.50）、（451.36±16.60），三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。72 h組氧合指數(shù)為（368.16±20.66），明顯下降，96 h組氧合指數(shù)為（123.39±11.46），達到最低值。NAC干預組氧合指數(shù)為（335.12±15.28），較96 h組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 肺系數(shù)

隨高氧暴露時間延長，大鼠肺系數(shù)呈逐漸增高趨勢，24 h組為（0.63±0.05），0 h組為（0.60±0.07），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；72 h組為（0.85±0.06），與48 h組（0.65±0.05）相比，顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；96 h組為（1.05±0.12），達到高峰，NAC干預組（0.86±0.06）同96 h組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 肺組織和血清MDA含量

隨高氧暴露時間的延長，大鼠肺組織和血清MDA含量逐漸增高，96 h達到峰值。NAC干預組較96 h組顯著下降（見表1）。

表 1 六組大鼠肺組織和血清的MDA含量Tab 1 The contents of MDA in the lung and serum in six groups

2.5 肺組織和血清SOD活性

隨高氧暴露時間的延長，大鼠肺組織和血清SOD活性呈逐漸下降趨勢，96 h達到最低值。NAC干預組較96 h組SOD活性顯著增高（見表2）。

表 2 六組大鼠肺組織和血清SOD活性Tab 2 The levels of SOD in the lung and serum in six groups

2.6 肺組織和血清T-AOC活性

隨高氧暴露時間的延長，大鼠肺組織和血清T-AOC活性逐漸下降，96 h達到最低值。NAC干預組較96 h組T-AOC活性顯著升高（見表3）。

表 3 六組大鼠肺組織和血清T-AOC活性Tab 3 The levels of T-AOC in the lung and serum in six groups

2.7 肺組織病理學改變

正常對照組肺組織形態(tài)結構清晰，無炎性細胞浸潤。隨著高氧暴露時間延長，肺泡壁增厚、結構破壞，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，以96 h組病理學改變最為明顯。NAC干預組大鼠肺泡壁結構破壞、炎性細胞浸潤及出血情況均較96 h組減輕。

3 討論

急性缺氧性呼吸衰竭的救治通常需要進行高濃度氧療，以保證重要臟器的氧氣供應，但高濃度氧是一把雙刃劍，在改善供氧同時也會引起機體肺結構和功能的損害，即高氧肺損傷，輕者影響患者的生活質量，重者可危及患者生命。對于早產(chǎn)或新生兒等正在發(fā)育中的肺組織，高氧甚至會造成不可逆的畸形發(fā)育，導致慢性肺疾病如支氣管肺發(fā)育不良、肺氣腫等[1]。高氧誘導的急性肺損傷主要的特征是：炎癥細胞的聚集，肺組織通透性的增加以及血管內皮和肺泡上皮細胞的損傷和/或凋亡[4]。進一步探索高氧肺損傷的發(fā)病機制及探索相關的防治藥物具有重要的理論及現(xiàn)實意義。

生理狀態(tài)下體內存在少量的氧自由基，但由于氧自由基清除劑的存在，機體并不會出現(xiàn)嚴重的組織損傷。高濃度氧暴露后可直接導致體內氧自由基及ROS產(chǎn)生明顯增多，造成肺泡上皮細胞的損傷，肺泡或間質的巨噬細胞發(fā)生應答，早期反應的細胞因子如TNF-α、IL-1β表達，從而活化肺內宿主細胞如內皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞，導致趨化因子的產(chǎn)生，并通過一個復雜的網(wǎng)絡調節(jié)這種炎癥反應過程[5-6]。目前對于成年動物高氧肺損傷的研究較為少見，主要集中于新生或幼年動物的相關研究，但不同年齡組動物對高濃度氧的反應存在明顯不同，細胞因子的表達和釋放存在顯著差異[3]。本研究選擇成年大鼠作為研究對象，給予持續(xù)高濃度氧氣吸入，觀察成年大鼠高氧肺損傷的動態(tài)發(fā)展過程，能夠更好的模擬成年人高氧肺損傷的肺部損害機制。

我們的研究結果表明，隨著高濃度氧氣暴露時間的逐漸延長，實驗大鼠的氧合指數(shù)呈逐漸下降趨勢，72 h出現(xiàn)顯著下降，提示大鼠在72 h開始出現(xiàn)肺部損害，96 h氧合指數(shù)達到ARDS診斷標準，發(fā)生嚴重的肺損傷。肺系數(shù)隨著吸入高濃度氧時間的逐漸延長呈逐漸增高趨勢，并于96 h達到高峰，反映機體肺組織水腫程度隨著高氧暴露時間的延長逐漸加重。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質過氧化而形成的脂質過氧化產(chǎn)物。肺是富含脂質的器官，容易受到氧自由基的攻擊，形成脂質過氧化物，脂質過氧化物進一步分解又能引起細胞的損傷[7]。本研究顯示：隨著高氧暴露時間的延長，肺組織和血清中MDA含量逐漸增加，96 h達到高峰，說明在高氧肺損傷時有大量的脂質過氧化物產(chǎn)生，這種氧化性損害持續(xù)存在，氧自由基與肺部脂質發(fā)生過氧化反應，引發(fā)脂質過氧化鏈鎖反應所致。SOD是抗氧化酶類，SOD的高低可以間接反映機體清除氧自由基的能力[8-9]。本研究顯示高氧暴露后SOD的活性逐漸下降，并持續(xù)存在于整個過程。高氧暴露后T-AOC逐漸下降，反映機體抗氧化能力下降。SOD、T-AOC活性下降和MDA含量升高反映了體內氧化/抗氧化平衡的失調。氧化/抗氧化失衡可以進一步引起蛋白質損傷、DNA損傷、改變信號傳導通路、刺激轉錄因子活化、誘導細胞凋亡，引起肺組織的過度損傷。

N-乙酰半胱氨酸對多種呼吸道疾病如COPD、ARDS、肺間質纖維化等具有較好的治療和預防作用[10]。作為一種氧自由基清除劑，在動物試驗中NAC能夠減輕LPS、氯氣、光氣等多種原因誘導所致的急性肺損傷[11-12]。已有研究表明，NAC通過誘導SOD的表達在一定程度上改善幼年或新生動物的高氧肺損傷[13]，尚未檢索到NAC在成年動物高氧肺損傷的研究報道，而成年動物對高氧的病理生理反應與幼年動物不同[3]。我們的研究結果表明，NAC預處理后成年大鼠氧合明顯改善，肺水腫程度減輕，肺組織及血清中MDA水平顯著下降，SOD、T-AOC活性明顯改善，提示NAC具有改善氧合，減輕大鼠肺水腫程度，并通過抑制機體氧化應激反應在一定程度上減輕高氧所致成年大鼠急性肺損傷，為探討高氧肺損傷的藥物防治提供新的依據(jù)。

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