高效液相色譜法測(cè)定嘎日迪五味丸中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿含量

王 巖，劉欣欣

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016; 2.遼寧普誠(chéng)醫(yī)藥有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110014)

嘎日迪五味丸為1998年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》收載的方劑，主要由制草烏、訶子、人工麝香、水菖蒲和木香組方，是治療風(fēng)濕、頭痛、白喉、炭疽、壞血病、瘰疬瘡瘍、疥癬等的一種蒙藥制劑。在文獻(xiàn)[1－2]的基礎(chǔ)上，筆者采用高效液相色譜法對(duì)嘎日迪五味丸中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－10AT高效液相色譜儀，Anstar工作站;BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);BU3120型超聲儀。嘎日迪五味丸(內(nèi)蒙古庫(kù)倫蒙藥廠，批號(hào)為090901);烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為0720－9807，0799－9403，0798－9403);甲醇、氯仿、三乙胺為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Symmetry C18柱(150 mm × 4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇 －水 －氯仿 －冰醋酸 －三乙胺 (50∶50∶2∶1∶0.6);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:25 ℃。

2.2 溶液制備

精密稱取烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿對(duì)照品適量，加水溶解制成每1 mL溶液分別含烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿90 μg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。稱取那嘎日迪五味丸劑粉末約25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，滴加5滴氨水，加無(wú)水乙醚100 mL，超聲振蕩30 min，放置3 h，過(guò)濾，殘?jiān)脽o(wú)水乙醚25 mL洗滌3次，合并濾液，回收溶劑，殘留物用二氯甲烷溶解，定量轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按處方制備不含草烏的樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察[3－4]:準(zhǔn)確量取對(duì)照品溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，分別置1 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，分別取10 μL進(jìn)樣分析。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的回歸方程分別為 A1=2.084×106C+3.120 × 104，A2=1.827 × 106C+1.680 × 104，A3=1.618 ×106C －3.970 ×104，相關(guān)系數(shù) r分別為 0.9996，0.9998，0.9998。結(jié)果表明，烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的質(zhì)量濃度均在9.0～45.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

回收率試驗(yàn):精密稱取樣品(批號(hào)為090901)粉末9份，每份25 g，分別加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液制備方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品，依法制備供試品溶液6份并測(cè)定含量。結(jié)果烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿含量的 RSD分別為0.82%，0.64% ，0.77%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):吸取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8，12 h 時(shí)測(cè)定。結(jié)果烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿面積的 RSD分別為0.88%，0.94%，1.02%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取批號(hào)為090901的樣品，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法測(cè)定樣品中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的含量(mg/g)。結(jié)果樣品中烏頭堿含量為0.00186%，中烏頭堿含量為0.00562%，次烏頭堿含量為0.00513%。

3 討論

高效液相色譜法測(cè)定制劑中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿含量的研究較多，多以甲醇－氯仿－水和乙腈－氯仿水系統(tǒng)為主，但嘎日迪五味丸藥味較多，單純的上述流動(dòng)相均難以分離測(cè)定。文獻(xiàn)[3]報(bào)道，流動(dòng)相中加入三乙胺等堿性調(diào)節(jié)劑。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在選用的色譜條件下加堿性調(diào)節(jié)劑可以改善色譜峰的對(duì)稱度，但烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿保留時(shí)間附近色譜峰的分離度不令人滿意。為此在流動(dòng)相系統(tǒng)中加入少量的冰醋酸使形成緩沖鹽溶液，結(jié)果使嘎日迪五味丸中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的峰形、與其他物質(zhì)的分離度等均達(dá)到了含量測(cè)定的要求。

在試驗(yàn)過(guò)程中，使用的檢測(cè)器是紫外－可見(jiàn)光檢測(cè)儀，由于烏頭類生物堿結(jié)構(gòu)中只有1個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此其摩爾吸光系數(shù)較小，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度需較高。在本試驗(yàn)中使用的高效液相色譜儀及反相色譜柱，測(cè)定烏頭類生物堿的含量時(shí)，進(jìn)樣量(體積)對(duì)其色譜行為有較大的影響。在進(jìn)樣量較小時(shí)，才能得到較好的色譜峰。因此，采用人為控制進(jìn)樣量，通過(guò)多次進(jìn)樣(RSD＜2%)，取平均值。文中所用方法簡(jiǎn)單、可行，重現(xiàn)性好，適用于嘎日迪五味丸中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的含量測(cè)定。

[1]韓國(guó)忠，白玉霞.蒙藥嘎日迪五味丸研究概況[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，24(5):563 －565.

[2]李麗敏，王欣美，王 柯，等.RP－HPLC測(cè)定鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊中3種烏頭類生物堿含量[J].中成藥，2008(12):1785－1789.

[3]陶淑娟，邵太麗，畢開(kāi)順.RP－HPLC法測(cè)定蒙藥那如3味丸中烏頭類生物堿含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(3):197－199.

[4]陳曉穎，梁基智，梁松慶，等.高效液相色譜法測(cè)定舒絡(luò)靈酊劑中次烏頭堿的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008(2):106－107，111.