用紫外分光光度儀測定總蛋白試劑盒的吸收峰和吸光度

何樂春

重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗中心（重慶市醫(yī)療器械質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心），重慶 401121

總蛋白由白蛋白和球蛋白組成，是血漿固體成分中含量最多、組成復(fù)雜、功能廣泛的一類化合物?？偟鞍椎臋z查是主要檢測肝功能代謝能力的試驗，反映肝臟的儲備能力?？偟鞍咨咄怯捎谝环N或多種免疫球蛋白增加所引起的，如急性失水、代謝鈉丟失、多發(fā)性骨髓瘤等；總蛋白降低大多是由于白蛋白的降低所引起，如水鈉潴留、長期營養(yǎng)不良、嚴(yán)重結(jié)核、甲亢和惡性腫瘤等。因此，臨床上檢測血清總蛋白及其組分，不僅可作為評價營養(yǎng)狀態(tài)及消化功能的指標(biāo)，而且對肝臟疾病、腎臟疾病、出血性疾病和免疫性疾病等的診斷、治療和預(yù)后判斷有重要價值。

1 儀器與材料

1.1 儀器

雙光束紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司，型號：TU-1901）、電熱恒溫度水浴鍋。

1.2 材料

選用8個廠家生產(chǎn)的總蛋白測定試劑盒，依次編號為1～8號（表1）。TruLab N復(fù)合定值質(zhì)控血清（正常值）為德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司生產(chǎn)，批號：12335。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗原理

雙縮脲法：在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與二價銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)生成紫紅色的絡(luò)合物，其中每個銅離子與5～6個肽鍵絡(luò)合，在540～550 nm范圍內(nèi)有最大吸收峰，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即蛋白質(zhì)含量成正比，經(jīng)與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求得蛋白質(zhì)的含量。該法為臨床測定血清總蛋白的首選方法[1-3]。

表1 各總蛋白試劑盒主要成分配方

2.2 試驗方法

2.2.1 選擇8個廠家生產(chǎn)的總蛋白試劑盒，分別按說明書中要求將質(zhì)控血和相應(yīng)試劑按一定比例進(jìn)行加樣，然后將所得混合液在紫外分光光度儀上進(jìn)行掃描，檢出相應(yīng)吸收峰和吸光度（表 2）。

2.2.2 第一次試驗掃描時用蒸餾水調(diào)零（即用蒸餾水走基線），再用紫外分光光度儀對其混合液進(jìn)行掃描，連續(xù)掃描兩次，得出吸收峰及相應(yīng)吸收度。

2.2.3 第二次試驗掃描時用各自廠家生產(chǎn)的試劑調(diào)零（即用試劑走基線），再用紫外分光光度儀對其混合液進(jìn)行掃描，連續(xù)掃描兩次，得出吸收峰及相應(yīng)吸收度。

2.2.4 以4號廠家的吸光度為基礎(chǔ)，其他7個廠家分別按質(zhì)控血清∶試劑的比例計算出相應(yīng)的理論吸光度和誤差[4-5]。誤差=[（測定值-理論值）/理論值]×100%。

表2 各總蛋白試劑盒的加樣量及試驗條件

2.3 結(jié)果

2.3.1 以蒸餾水調(diào)零所得的吸收峰和吸光度：用蒸餾水調(diào)零后，對其混合液連續(xù)掃描2次，分別得出吸收峰及相應(yīng)吸光度（表3），吸收峰圖譜見圖1。

表3 各總蛋白試劑盒的吸收峰和吸光度（以蒸餾水調(diào)零）

圖1 以蒸餾水調(diào)零后所得的總蛋白吸收峰圖譜

2.3.2 以試劑調(diào)零所得的吸收峰和吸光度∶用試劑調(diào)零后，對其混合液連續(xù)掃描兩次，分別得出吸收峰及相應(yīng)吸光度（表4），吸收峰圖譜見圖2。

表4 各總蛋白試劑盒的吸收峰和吸光度（以試劑調(diào)零）

圖2 以試劑調(diào)零后所得的總蛋白吸收峰圖譜

2.3.3 理論吸光度和誤差的計算：以4號廠家的吸光度為基礎(chǔ)，計算出相應(yīng)的理論吸光度和誤差（表5）。

表5 各總蛋白試劑盒的理論吸光度和誤差

3 討論

從表3、4檢出的吸收峰波長結(jié)果以及相應(yīng)的圖譜來看，表3所檢出的吸收峰波長已遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離了說明書中要求的吸收峰波長，表4檢出的吸收峰波長在正常范圍內(nèi)。即第一次試驗掃描雖然是以蒸餾水調(diào)零，對混合液進(jìn)行平行操作掃描，但連續(xù)兩次掃描所得吸收峰波長和理論吸收峰波長之差在10 nm以上，且圖譜比較亂，沒有規(guī)律性；而用各自廠家生產(chǎn)的試劑調(diào)零后，檢出的吸收峰和理論吸收峰一致，吸收峰之差均在10 nm以內(nèi)，相應(yīng)圖譜顯示吸收峰明顯，有一定規(guī)律性。

在分析方法學(xué)上，8個廠家生產(chǎn)的試劑盒均采用的是終點法。從紫外分光光度儀的特性來講，任一物質(zhì)通過儀器掃描所得的吸收峰和理論吸收峰之差都應(yīng)在±2 nm內(nèi)，這樣所得的結(jié)果才能經(jīng)得起驗證，但考慮到體外診斷試劑的特殊性，所以吸收峰之差在10 nm以內(nèi)均認(rèn)同和理論值吸收峰值相一致。

從表4、5的比較中可看出3、5、6號的吸光度與理論吸光度幾乎一致，誤差＜2%，而 1、2、7、8號的吸光度與理論吸光度存在一定差異，誤差范圍在20%以內(nèi)，排除在試驗操作過程中一些不確定的因素如人為誤差等，各自廠家生產(chǎn)的試劑對其吸光度值起著決定性的作用。8個廠家生產(chǎn)的總蛋白試劑盒均為單試劑，除了1號廠家加了適量防腐劑外，其余廠家的配方完全一樣，在試驗中都用的是終點法且反應(yīng)原理一樣，之所以出現(xiàn)吸光度值的差異與各自廠家配方的比例不一致有關(guān)。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].三部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅥB.

[2]朱鐵志.脂血標(biāo)本總蛋白測定方法的探討[J].中國醫(yī)學(xué)檢驗雜志,2009,10(2):94-95.

[3]王霞文.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗[M].南京:南京大學(xué)出版社,1995:180-182.

[4]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗手冊[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:452-456.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T 124-1999臨床化學(xué)體外診斷試劑盒質(zhì)量檢驗總則[S].1999.