超聲法提取石榴皮多酚的研究

汝紹剛，趙文英，崔 波，朱 政，朱慶書

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042；2.棗莊職業(yè)學(xué)院，山東 棗莊 277800)

石榴多酚是一類具有多酚羥基化合物的總稱，主要存在于石榴皮中，含量約為其干質(zhì)量的10%～20%，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、降血壓和預(yù)防心腦血管疾病等多種生理和藥理活性[1]，在食品、醫(yī)藥和日用化學(xué)品等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值。

傳統(tǒng)中藥存在有效成分含量低、雜質(zhì)多、質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，這主要是由于提取工藝不穩(wěn)定、提取效率低引起的。因此，提取工藝直接關(guān)系到中藥材的利用率和后續(xù)加工的難易，是中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化的重要環(huán)節(jié)[2]。因此，優(yōu)化石榴多酚的提取工藝十分必要。

目前石榴多酚的提取多采用煎煮法。該法具有操作簡(jiǎn)便、成本低等特點(diǎn)，但易破壞活性成分、雜質(zhì)含量高、分離純化困難。超聲提取是利用超聲波輻射產(chǎn)生的強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、高的加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌等多種作用，加快物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度、增大溶劑的穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑。超聲提取技術(shù)已應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等各個(gè)領(lǐng)域，特別是在中藥材成分提取中應(yīng)用廣泛[3～5]。

作者采用超聲技術(shù)從石榴皮中提取石榴多酚，考察了相關(guān)因素對(duì)提取率的影響，并比較了超聲提取法和回流提取法的提取效率。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

石榴籽購自棗莊。

所用試劑均為分析純。

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；T-6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，普析通用儀器有限責(zé)任公司；循環(huán)水多用真空泵，河南鞏義英峪予華儀器廠；DZF-6051型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 超聲提取石榴皮多酚

稱取粒徑20目的石榴皮粉末5 g，置于250 mL錐形瓶中，加入40%乙醇50 mL，置于超聲儀內(nèi)30 ℃超聲振蕩30 min，取出，以2000 r·min-1離心沉降10 min，沉降液即為多酚提取液。

1.3 回流提取石榴皮多酚

稱取粒徑40目的石榴皮粉末5 g，按1∶15(g∶mL)的料液比加入40%乙醇，加熱至微沸回流提取。分別在30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、90 min、110 min時(shí)，取少量提取液以2000 r·min-1離心沉降10 min，沉降液即為多酚提取液。

1.4 石榴皮多酚含量的測(cè)定[6]

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度；精密量取5 mL，置50 mL棕色瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(沒食子酸濃度0.05 mg·mL-1)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬酸試液1.0 mL，再分別加水至12.0 mL，加29% Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，測(cè)定760 nm波長(zhǎng)處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合得到回歸曲線y=3.7758x-0.0018(R=0.9997)，表明沒食子酸在0.01～0.001 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.3 樣品溶液的制備

精密量取一定體積揮去溶劑的石榴皮提取液，加水稀釋至一定倍數(shù)，搖勻，即得樣品溶液。

1.4.4 多酚含量的測(cè)定

總酚含量：精密量取樣品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法自“加入磷鉬酸試液1.0 mL”起，加水10 mL，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出樣品中沒食子酸的量(mg)，計(jì)算，即得。

不被吸收的多酚含量：精密量取樣品溶液25 mL，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置(30±2) ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出放冷，濾過，棄初濾液，精密吸取續(xù)濾液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法自“加入磷鉬酸試液1.0 mL”起，加水10 mL，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出樣品中沒食子酸的量(mg)，計(jì)算，即得。

按下式計(jì)算石榴皮多酚含量：

石榴皮多酚含量=總酚含量-不被吸收的多酚含量

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

石榴皮多酚結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，極性較大，根據(jù)相似相溶原理，在含水醇中溶解度較大。分別以純水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇為溶劑，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)提取率最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過40%后，由于溶劑的極性有所降低，石榴皮多酚的溶解度逐漸下降。因此，選用40%乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 石榴皮粒徑的影響

在石榴皮粒徑分別為10目、20目、40目、60目的條件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察石榴皮粒徑對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 石榴皮粒徑對(duì)提取率的影響

由圖2可知，石榴皮粒徑對(duì)超聲提取率的影響很明顯。隨著粒徑的減小，提取率明顯提高。這是因?yàn)?，粒徑減小意味著藥材完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)的有效成分更容易提取出來。因此，為了更快更完全地浸出有效成分，在石榴皮預(yù)處理(粉碎)時(shí)，必須盡量破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使石榴皮粒徑盡可能地小，同時(shí)石榴皮應(yīng)該具有必要的機(jī)械結(jié)構(gòu)性能，以保證溶劑在粒子和粒子之間滲透良好。

2.1.3 提取時(shí)間的影響

在石榴皮粒徑為60目，提取時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的條件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖3可知，提取時(shí)間對(duì)石榴皮多酚提取率影響明顯。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率不斷上升；但提取時(shí)間超過50 min后，提取率反而下降。這是因?yàn)?，超聲波?duì)細(xì)胞壁有破壞作用，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，破壞程度加大，溶出物增多，提取率相應(yīng)升高；但提取時(shí)間超過50 min后，由于多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能被超聲波所破壞，導(dǎo)致提取率有所下降。

2.1.4 提取溫度的影響

在石榴皮粒徑為60目，提取溫度分別為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的條件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察提取溫度對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)提取率的影響

由圖4可知，在較低溫度下，隨著提取溫度的升高，提取率不斷上升；但提取溫度超過40 ℃后，隨著提取溫度的升高，提取率反而下降。

藥材提取率的高低主要與溶劑的溶解能力有關(guān)，而溶劑的溶解能力又與溫度相關(guān)聯(lián)。提取溫度升高，就會(huì)增加溶劑分子和有效成分分子的動(dòng)能，加速分子運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)有效成分溶解。在超聲波下，溫度對(duì)提取率的影響遵循同樣的規(guī)律，但提取率的提高不完全歸因于溶劑溶解能力的影響。超聲作用引起的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等也有一定的貢獻(xiàn)。一般來說，溫度升高，溶劑的表面張力系數(shù)及粘滯系數(shù)下降，蒸汽壓增大，超聲空化域值下降，有利于空化泡的產(chǎn)生；另一方面，蒸汽壓增大(由于溫度的升高)，又會(huì)導(dǎo)致空化強(qiáng)度或空化效應(yīng)下降，從而不利于提取過程的強(qiáng)化。從超聲空化引起提取率升高的角度說，應(yīng)在較低溫度條件下工作，利用在較低的溫度下強(qiáng)烈的空化效應(yīng)進(jìn)行超聲提取達(dá)到單純升高溫度時(shí)同樣的效果。因此，在石榴皮多酚提取過程中，適當(dāng)升高溫度有利于提高提取率。但溫度過高會(huì)造成溶劑氣化，浸出過程難以進(jìn)行，也不利于提高提取物的質(zhì)量。

2.1.5 料液比的影響

在石榴皮粒徑為60目，料液比(g∶mL，下同)分別為1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20的條件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察料液比對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)提取率的影響

由圖5可知，隨著溶劑用量的增大，石榴皮多酚的提取率明顯升高。這是由于溶劑用量大，溶劑中石榴皮多酚的相對(duì)濃度低，物料及溶劑邊界層的石榴皮多酚濃度差大，擴(kuò)散推動(dòng)力大，因而提取率升高，但溶劑用量超過一定程度后，提取率升幅趨緩。因而溶劑量太大在經(jīng)濟(jì)上不合算。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石榴皮多酚提取率影響較小，因而確定提取溶劑為40%乙醇。在此基礎(chǔ)上，以料液比、石榴皮粒徑、提取時(shí)間、提取溫度為主要影響因素，通過正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表1可以看出，對(duì)提取率影響最顯著的因素是石榴皮粒徑，為保證較佳的提取率，實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格控制石榴皮粒徑；而提取溫度的影響最小，可以根據(jù)具體情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。確定石榴皮多酚的最佳超聲提取條件為：以40%乙醇為溶劑，石榴皮粒徑40目，提取溫度30 ℃，提取時(shí)間50 min，料液比1∶15。在此條件下提取3次，提取率分別為15.86%、17.13%、16.32%，平均提取率為16.44%，高于正交實(shí)驗(yàn)中最高提取率，證明本實(shí)驗(yàn)確定的提取條件是合理的。

2.3 超聲提取法與回流提取法比較(圖6)

圖6 超聲提取法與回流提取法比較

由圖6可知，超聲提取法和回流提取法的提取率都隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，回流提取110 min與超聲提取50 min的提取率接近。對(duì)于超聲提取法，提取時(shí)間過長(zhǎng)反而會(huì)使提取率下降；而回流提取法在提取率增加到一定程度后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率升幅不明顯。超聲提取法的提取率明顯高于回流提取法，即使加熱回流提取在70 min后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，其提取率也比超聲提取的最大提取率低。這表明超聲提取法無論是提取時(shí)間還是提取率均優(yōu)于回流提取法。

3 結(jié)論

(1)利用超聲提取法提取石榴皮中的石榴多酚，通過正交實(shí)驗(yàn)確定各因素對(duì)提取率的影響大小依次為：石榴皮粒徑>料液比>提取時(shí)間>提取溫度。最佳提取條件為：40%乙醇為溶劑，石榴皮粒徑40目，提取溫度30 ℃，提取時(shí)間50 min，料液比1∶15(g∶mL)。此條件下平均提取率達(dá)16.44%。

(2)超聲提取法與回流提取法相比，回流提取110 min與超聲提取50 min的提取率接近，因此，超聲提取法具有耗時(shí)短、節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，作為中藥有效成分提取的新方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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