HPLC法測定三氟柳的含量及有關(guān)物質(zhì)

郭海波，郭旭光，查 嶺

(1.河南省藥品審評認(rèn)證中心，河南 鄭州 450004；2.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003；3.周口市中心醫(yī)院，河南 周口 466000)

三氟柳(Triflusal)是一種抗血小板凝聚劑，能通過不可逆地抑制血小板環(huán)氧化酶，而減少血栓素合成酶的生物合成，從而抑制血小板的聚集。三氟柳在臨床上廣泛應(yīng)用于預(yù)防中風(fēng)和心肌梗塞，其療效確切、安全可靠[1，2]。自1981年起，三氟柳先后在西班牙、巴西、墨西哥、秘魯?shù)葒疑鲜?，我國尚未進(jìn)口該產(chǎn)品。關(guān)于其檢測方法的報道也非常少。為了更有效地控制三氟柳的質(zhì)量，作者建立了測定三氟柳含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

三氟柳原料藥(批號：20100501、20100502、20100503)，常州萊恩化工有限公司；三氟柳對照品(原料藥精制，純度99.96%)；乙腈和甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀，G1314A VWD型檢測器，Agilent ChemStation 工作站；Sartorius BP211D型電子天平。

1.2 方法[3,4]

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察

色譜條件：采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL·min-1。

首先稱取三氟柳對照品適量，用流動相制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，在200～400 nm波長處掃描，繪制紫外吸收光譜圖，選擇適宜的檢測波長；然后從不同配比的甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)中選擇適宜的流動相；最終確定適宜的色譜條件。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在此色譜條件下進(jìn)行。

1.2.2 線性關(guān)系考察

稱取三氟柳對照品20.25 mg，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取貯備液1 mL、2 mL、5 mL、7 mL、10 mL置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為0.081 mg·mL-1、0.162 mg·mL-1、0.41 mg·mL-1、0.567 mg·mL-1、0.81 mg·mL-1，進(jìn)樣測定峰面積。以三氟柳濃度為橫坐標(biāo)(x，mg·mL-1)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取1.2.2中濃度為0.41 mg·mL-1的溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。

1.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取三氟柳原料藥(批號20100501)約10 mg，連續(xù)稱定6份，分別置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取三氟柳對照品約10 mg，同法配制，作為對照品溶液。分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法由峰面積計算樣品三氟柳含量。

1.2.5 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取三氟柳原料藥(批號20100501)10.18 mg，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。室溫放置，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h測定峰面積。

1.2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批已知含量的三氟柳原料藥(批號20100501)約8 mg、10 mg、12 mg各3份，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取三氟柳對照品約10 mg，同法配制溶液，作為對照品溶液。分別精密量取10 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法由峰面積計算測得量及回收率。

1.2.7 檢測限測定

取1.2.2中濃度為0.081 mg·mL-1的溶液，用流動相逐級稀釋成一系列濃度的溶液，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.8 專屬性實(shí)驗(yàn)

精密稱取三氟柳原料藥(批號20100501)約20 mg，置50 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為樣品貯備液。按下述方法制備供試液，進(jìn)樣測定HPLC色譜圖。

(1)酸破壞實(shí)驗(yàn)：取樣品貯備液5 mL，加入1 mol·L-1的鹽酸溶液1 mL，靜置1 h，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試液。

(2)堿破壞實(shí)驗(yàn)：取樣品貯備液5 mL，加入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL，靜置1 h，加入1 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試液。

(3)氧化破壞實(shí)驗(yàn)：取樣品貯備液5 mL，加入30%H2O2溶液1 mL，靜置1 h，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試液。

(4)高溫破壞實(shí)驗(yàn)：取樣品貯備液5 mL，置水浴加熱2 h，冷卻，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試液。

(5)光照破壞實(shí)驗(yàn)：取樣品貯備液5 mL，置4500 Lx強(qiáng)光下照射3 d，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試液。

1.2.9 樣品三氟柳含量及有關(guān)物質(zhì)測定

精密稱取三氟柳原料藥約10 mg，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另精密稱取三氟柳對照品約10 mg，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

(1)三氟柳含量測定：分別精密量取供試品溶液和對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法由峰面積計算三氟柳含量。

(2)有關(guān)物質(zhì)測定：精密量取對照溶液10 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰的峰高約為記錄儀滿量程的20%～25%，記錄色譜圖；再精密量取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，以不加校正因子的主成分自身對照法由峰面積計算樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三氟柳在224 nm和278 nm波長處有最大吸收，因224 nm接近溶劑乙腈的末端吸收區(qū)域，故選擇278 nm作為檢測波長。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水、乙腈-水作流動相時，三氟柳主峰峰形較寬，拖尾，與雜質(zhì)峰分離度較差。通過改變水相的酸性并加入四氫呋喃調(diào)節(jié)流動相的極性，使得三氟柳主峰峰形對稱，理論板數(shù)高，主峰與各雜質(zhì)及降解產(chǎn)物達(dá)到基線分離，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果滿意。

最終確定的色譜條件為：采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，0.3%磷酸水溶液-乙腈-四氫呋喃(60∶30∶10)為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長278 nm。在上述條件下，理論板數(shù)以三氟柳峰計不低于3000，主峰與各雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，分離度大于2。

2.2 線性關(guān)系

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合線性回歸方程為：y=2225.801x-54.059，R=0.9992，表明三氟柳濃度在0.081～0.81 mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度

精密度實(shí)驗(yàn)測得樣品的峰面積分別為826.94、829.86、823.27、831.01、821.95、825.06，RSD(n=6)為0.44%，表明方法的精密度良好。

2.4 重復(fù)性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測得三氟柳的平均含量為99.18%，RSD(n=6)為0.28%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測得樣品的峰面積分別為847.83、852.47、845.76、844.85、839.17、843.28、836.87，RSD(n=7)為0.62%，表明本品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，能夠滿足檢測需要。

2.6 回收率

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1計算3個濃度下平均回收率為98.25%，RSD(n=3)為1.11%。

2.7 檢測限

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液濃度為162 ng·mL-1時，色譜峰信噪比為3∶1，表明三氟柳的最低檢測限為1.62 ng。

2.8 專屬性

三氟柳降解產(chǎn)物的HPLC色譜圖見圖1。

a.酸破壞樣品 b.堿破壞樣品 c.氧化破壞樣品 d.高溫破壞樣品 e.光照破壞樣品

由圖1可知，供試液經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰能與三氟柳峰有效分離，分離度均大于1.5，表明方法的專屬性良好。

2.9 樣品三氟柳含量及有關(guān)物質(zhì)(表2)

表2 三氟柳含量及有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 結(jié)論

采用HPLC法測定三氟柳的含量及有關(guān)物質(zhì)。色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.3%磷酸水溶液-乙腈-四氫呋喃(60∶30∶10)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長278 nm。結(jié)果表明，三氟柳與各雜質(zhì)及降解產(chǎn)物分離良好，在0.081～0.81 mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(R=0.9992)，平均回收率為98.25%，RSD為1.11%，最低檢測限為1.62 ng。該方法操作簡便、靈敏、準(zhǔn)確度高，可用于三氟柳的質(zhì)量控制。

[1]McNeely W，Goa K.Triflusal[J].Drugs，1998，55(6)：823-833.

[2]Murdoch D，Plosker G L.Triflusal：A review of its use in cerebral infarction and myocardial infarction，and as thromboprophylaxis in atrial fibrillation[J].Drugs，2006，66(5)：671-692.

[3]European Pharmacopoeia Commission Strasbourg:European Directorate for the Quality of Medicine Health Care EP7.0[S].2010：3137-3138.

[4]國家藥典委員會.中國藥典(二部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄194-195.