HPLC法測定苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿

毛 丹， 陳 鈳， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203)

苦參軟膏主要含苦參總堿，具有抗菌消炎作用，主要用于治療宮頸糜爛、赤白帶下、滴蟲性陰道炎及陰道霉菌感染等婦科慢性炎癥。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是采用酸堿滴定法［1］測定總生物堿的量，操作繁瑣，專屬性差。苦參總堿中含有苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿，是苦參總堿的主要活性成分。為有效控制藥品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法［2-8］同時(shí)測定苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的量，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和修訂提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀，紫外-可見光檢測器，Chemstation色譜工作站。苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對(duì)照品均由中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為 805-200005、110784-200303、0780-200004。樣品:苦參軟膏樣品(批號(hào)為20100802，20100803，20100804)及陰性樣品均由上海寶龍藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜純(Merck公司)，其余試劑均為分析純，由中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-3柱(5 μm，0.46 cm ×15 cm)，流動(dòng)相為乙腈 －0.1%磷酸溶液(18 ∶82，v/v)(三乙胺調(diào)節(jié) pH 值至 8.0)，體積流量:1.0 mL/min，檢測波長:220 nm，柱溫:30 ℃，進(jìn)樣量:5 μL。在上述色譜條件下，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的理論板數(shù)均不低于4000，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)稱因子在0.95～1.05之間。陰性對(duì)照溶液對(duì)樣品測定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對(duì)照品適量，分別加流動(dòng)相制成每1 mL 含苦參堿1.952 mg、槐定堿2.49 mg、氧化苦參堿1.002 mg的對(duì)照品溶液;精密吸取上述苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液各1 mL、1 mL和0.5 mL，混合，搖勻，作為對(duì)照品溶液①;另精密吸取上述苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液各1 mL、1 mL 和 0.5 mL，置 10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液②;再精密吸取對(duì)照品溶液②2 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液③。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液1 mL，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率140 W，頻率42 kHz)30 min，放冷，離心，取上清液5 mL，減壓回收至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取按處方除去苦參總堿的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液③2 μL，對(duì)照品溶液②1 μL、2 μL、5 μL，對(duì)照品溶液①2 μL、5 μL、10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程分別為:苦參堿Y=1059X+4.875，r=0.9999(n=7);槐定堿 Y=662.03X －1.311，r=0.9999(n=7);氧化苦參堿 Y=872.38X+0.633，r=0.9999(n=7);結(jié)果表明，苦參堿在進(jìn)樣量為 0.07808 ～7.808 μg、槐定堿在進(jìn)樣量為 0.0996 ～9.96 μg、氧化苦參堿在進(jìn)樣量為0.02004 ～2.004 μg 范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液②，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，計(jì)算苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰面積的RSD分別為1.6%、1.1%和1.1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于 0、4、9、14、21、25 h 進(jìn)樣測定，測得苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰面積的RSD分別為1.5%、0.49%和2.1%，結(jié)果表明供試品溶液在25 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.7%、1.2%和2.5%，結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9個(gè)具塞錐形瓶，分別精密加入對(duì)照品溶液(苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為 1.839 mg/mL、2.419 mg/mL、0.539 mg/mL，均用無水乙醇溶解)0.8 mL、1 mL 和1.2 mL，一式9份，以3份為一組，減壓回收至干，再取已測定的同一批樣品9份(含苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿分別為 18.0 mg/g、23.0 mg/g、3.3 mg/g)，精密稱定，置上述具塞錐形瓶中，按供試品溶液方法制備供試液，測定，結(jié)果見表1。

表1 苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.1 Recoveries of matrine，sophoridine and oxymatrine in Kushen Ointment(n=9)

2.8 樣品測定 按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和測定條件，取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液②作為對(duì)照品溶液，對(duì)3批樣品中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿進(jìn)行測定，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Content of matrine，sophoridine and oxymatrine in Kushen Ointment(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿混合對(duì)照品溶液經(jīng)二極管陣列檢測器進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果分別在204 nm、202 nm、202 nm處有最大吸收［9］，但在220 nm波長下，干擾少，基線穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，而且吸收度合適，故選擇220 nm作為檢測波長［10］。

3.2 流動(dòng)相和色譜柱的選擇 參照中國藥典2010年版一部“苦參”項(xiàng)下方法［11］188，以氨基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈－無水乙醇－3%磷酸溶液(80∶10∶10)為流動(dòng)相［12］，結(jié)果得到的供試品色譜圖中，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰不對(duì)稱，且槐定堿與氧化苦參堿色譜峰的分離度稍差;又參照中國藥典2010年版一部“消銀片”項(xiàng)下方法［11］1038，采用Inertsil ODS-3 的色譜柱(5 μm，0.46 cm ×15 cm)，以乙腈－0.1%磷酸溶液(18∶82)(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至8.0)為流動(dòng)相［13］，結(jié)果得到的供試品色譜圖中，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰較對(duì)稱，且與其他色譜峰均分離良好，故選擇該色譜柱與流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 苦參總堿中主要含有生物堿類成分，供試品溶液制備方法采用加濃氨試液使生物堿游離后加有機(jī)溶劑提取的方法［14］。為有效提取出苦參軟膏中的生物堿類成分，對(duì)供試品溶液制備方法中濃氨試液的加入量、提取溶劑、提取方式等分別進(jìn)行了考察。試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑進(jìn)行選擇時(shí)，分別篩選了二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚3種試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用三氯甲烷超聲處理提取效率最高，故采用三氯甲烷作為提取溶劑。濃縮方式分別采用蒸干、減壓回收至干2種進(jìn)行比較，結(jié)果表明，蒸干會(huì)導(dǎo)致所測定成分的含量偏低，故選擇減壓回收至干作為樣品的濃縮方式。同時(shí)我們?cè)谠囼?yàn)時(shí)還發(fā)現(xiàn)，使用無水乙醇配制的對(duì)照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖中溶劑峰對(duì)所測定的成分有干擾，故選擇用流動(dòng)相制備對(duì)照品溶液和供試品溶液。通過對(duì)供試品溶液的提取方法等進(jìn)行考察，最終確定了前述提取方法。

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