反相高效液相色譜法測定鹽酸米諾環(huán)素原位凝膠中鹽酸米諾環(huán)素的含量

楊躍輝，郜琪臻，丁平田

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110001；3.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110015)

鹽酸米諾環(huán)素(Minocycline hydrochloride，MINO·HCl)，又名美滿霉素、鹽酸二甲胺四環(huán)素、米諾四環(huán)素，為四環(huán)素族抗生素。鹽酸米諾環(huán)素是廣譜的抑菌劑，能抑制大部分牙周病原菌[1]；體外實(shí)驗(yàn)證明，鹽酸米諾環(huán)素的抑菌效果較其它抗菌藥好，臨床定期應(yīng)用鹽酸米諾環(huán)素可明顯減少微生物的數(shù)量[2]。將鹽酸米諾環(huán)素制成微膠囊型牙周緩釋原位凝膠，一周給藥一次，具有明顯的緩釋效果和確切的療效，可使藥物在牙周袋內(nèi)局部釋放，減少給藥劑量，提高局部藥物濃度，延長藥物在牙周袋內(nèi)的作用時(shí)間。

作者在此采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定鹽酸米諾環(huán)素原位凝膠中鹽酸米諾環(huán)素的含量。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

鹽酸米諾環(huán)素(MINO·HCl)、甘油(GLY)、羥乙基纖維素(HEC)、甘油三醋酸酯(TA)、氨烷基甲基丙烯酸酯共聚物、乙酸銨、氯化鉀(廣東汕頭西隴化工廠)、乙二胺四乙酸二鈉，分析純；乙腈、甲醇，色譜純；去離子水。

Sartorius BS 110S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；立式擴(kuò)散儀，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司；ZD-85A型恒溫氣浴振蕩器、85-2A 型恒溫磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；高效液相色譜儀、2201 型紫外掃描分光光度計(jì)，日本島津公司；半透膜，美國Biosharp公司；KQ-50B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙酸銨緩沖鹽溶液-乙腈(250∶105)；檢測波長350 nm；流速1.0 mL · min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

取鹽酸米諾環(huán)素約10 mg，置于25 mL量瓶中，加水5 mL使溶解后，置沸水浴中加熱60 min，冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻，取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取鹽酸米諾環(huán)素適量，置于100 mL量瓶中，加甲醇40 mL，振搖使溶解，加流動(dòng)相定容至刻度，即得鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

分別取鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，配制成不同濃度的鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液(分別相當(dāng)于米諾環(huán)素50 μg · mL-1、100 μg · mL-1、300 μg · mL-1、500 μg · mL-1、750 μg · mL-1、1000 μg · mL-1)。精密量取鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。擬合線性回歸方程為：A=5327c+ 19583(R=0.9999)。結(jié)果表明，鹽酸米諾環(huán)素在50～1000 μg · mL-1(以米諾環(huán)素計(jì))范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 鹽酸米諾環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

按1.2.3方法分別配制高、中、低三個(gè)濃度(相當(dāng)于米諾環(huán)素1000 μg·mL-1、500 μg·mL-1、50 μg·mL-1)的鹽酸米諾環(huán)素溶液各5份，置于4℃冰箱中，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀中，記錄液相色譜圖。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其濃度測定值，考察日內(nèi)和日間精密度。

1.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取空白原位凝膠適量，置于100 mL量瓶中，加甲醇40 mL，充分振搖，超聲助溶30 min，直至未見有膠狀物質(zhì)存于量瓶底部。精密稱取鹽酸米諾環(huán)素適量(相當(dāng)于米諾環(huán)素1000 μg · mL-1、500 μg · mL-1、50 μg · mL-1)。加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取10 μL供試品溶液注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其濃度測定值，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

精密稱取鹽酸米諾環(huán)素適量，用甲醇溶解，配制成10 μg · mL-1的溶液，以甲醇為參比，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，鹽酸米諾環(huán)素甲醇溶液在250 nm、350 nm處有最大吸收。

精密稱取空白原位凝膠適量，加適量甲醇，充分振搖，超聲助溶30 min，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，以甲醇為參比，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，空白原位凝膠在350 nm處無吸收。故選擇350 nm作為檢測波長。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性考察(圖2)

1.差向米諾環(huán)素 2.米諾環(huán)素

由圖2可知，米諾環(huán)素峰的拖尾因子應(yīng)在0.9～1.35之間，米諾環(huán)素峰與差向米諾環(huán)素峰(相對保留時(shí)間約為0.8 min)的分離度應(yīng)不小于2.5[3]。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)(表1)

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

由表1可知，日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，符合方法學(xué)要求。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)(表2)

由表2可知，回收率符合方法學(xué)要求。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 最低檢測限

配制一系列不同濃度的鹽酸米諾環(huán)素溶液，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，得到最低檢測限為10 ng · mL-1(S/N≥3)、定量限為50 ng · mL-1(S/N>10)。

2.6 樣品測定

取鹽酸米諾環(huán)素原位凝膠約2.5 g，置于100 mL量瓶中，加甲醇40 mL，充分振搖，超聲助溶30 min，直至未見有膠狀物質(zhì)存于量瓶底部，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，立即精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。4批樣品的含量測定結(jié)果見表3。

2.7 討論

在流動(dòng)相的選擇上，曾采用藥典的0.2 mol·L-1醋酸銨-二甲基甲酰胺-四氫呋喃(600∶398∶2，內(nèi)含0.2 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉)為流動(dòng)相，凝膠峰與樣品峰有干擾 ，不能達(dá)到良好的分離度。而用乙酸銨緩沖鹽溶液-乙腈(250∶ 105)為流動(dòng)相時(shí)，保留時(shí)間適宜，峰形好，樣品峰與凝膠峰無干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸銨緩沖鹽溶液-乙腈(250∶105)為流動(dòng)相。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=4)

3 結(jié)論

以乙酸銨緩沖鹽溶液-乙腈(250∶105)為流動(dòng)相，進(jìn)樣量10 μL，在350 nm處采用RP-HPLC法測定了鹽酸米諾環(huán)素原位凝膠中鹽酸米諾環(huán)素的含量，鹽酸米諾環(huán)素濃度在50～1000 μg · mL-1(以米諾環(huán)素計(jì))范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。該方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于鹽酸米諾環(huán)素原位凝膠中鹽酸米諾環(huán)素含量的測定。

[1] Baker P J，Evans R T，Slots J，et al. Susceptibility of human oral anaerobic bacteria to antibiotics suitable for topical use[J]. Journal of Clinical Periodontology，1985，12(3)：201-208.

[2] 任蕾，楊圣輝，劉穎. 牙周炎常見菌對抗菌藥物的篩選及活性測定[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，14(4)：256-260.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版(二部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：697-698.