正交設(shè)計法優(yōu)選土茯苓中落新婦苷及總黃酮的提取工藝

林耿豐，梁偉杰，肖鳳霞，鄧少東，鄧超明，黎杏儀

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006）

土茯苓是百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，具有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)的功效。用于濕熱淋濁、帶下、癰腫、瘰疬、疥癬、梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛［1］。土茯苓中主要含黃酮類化合物，其中的主要成分落新婦苷具抗炎鎮(zhèn)痛利尿之功效［2］，同時對于免疫性的肝損傷具有保護作用［3］，在2010版《中國藥典》中作為土茯苓質(zhì)量控制的指標性成分。土茯苓主產(chǎn)于廣東、湖南、安徽、湖北、浙江、四川等省份，其中有許多代用品及混淆品。為了更好地控制該藥材的質(zhì)量，本文采用正交試驗法研究土茯苓中落新婦苷和總黃酮的提取工藝，為科學評價該藥材質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

土茯苓藥材產(chǎn)地分別為廣東信宜、湖南、廣西梧州、廣西上思縣、香港及越南河內(nèi)；落新婦苷對照品（北京恒元啟天化工技術(shù)研究院公司，批號：A0102），蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080－200306）；甲醇（色譜純，迪馬公司，批號：50102），磷酸（分析純，天津市福晨化學試劑廠，批號：20080427），甲醇（分析純，天津市百世化工有限公司，批號：20100122），石油醚（分析純，天津市百世化工有限公司，批號：20100126），無水乙醇（分析純，天津市百世化工有限公司，批號：20100126），九水硝酸鋁（分析純，廣東光華化學廠有限公司，批號：20071109），氫氧化鈉（分析純，天津市耀華化學試劑有限責任公司，批號：20060712），亞硝酸鈉（分析純，天津市福晨化學試劑廠，批號：20100115）；怡寶水。

1.2 儀器

天美高效液相色譜儀（LC2000紫外檢測器，L－2200自動進樣器，L－2130四元泵，T2000工作站）；GZX－DH 型電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠）；BP211D電子天平（德 國 Sartorious）；KQ－500型超聲波清洗器（500W，40KHz，昆山市超聲儀器有限公司）；H.H.S型電熱恒溫水浴鍋（上海浦東躍欣科學儀器廠）；Cary 50型紫外可見分光光度計（美國瓦里安公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 落新婦苷的含量測定

2.1.1 正交實驗設(shè)計

以落新婦苷含量為指標，選擇甲醇用量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）為考察因素，各設(shè)3個水平（見表1）。從實驗結(jié)果（見表2、表3）可知，三種因素對落新婦苷含量沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），各因素影響順序依次為B（提取次數(shù)）＞A（甲醇用量）＞C（提取時間），最后綜合考慮各個因素，確定最佳提取工藝為加入甲醇30mL，超聲提取15min，超聲3次。

表1 落新婦苷提取因素水平

2.1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈－0.1%磷酸水（21：79，v／v）；流速：1.0mL／min；檢測波長：290nm；柱溫：室溫；進樣量：10μL。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)110℃干燥至恒重的落新婦苷對照品適量，加甲醇制成100.6μg·mL－1的落新婦苷對照品溶液，作為對照品儲備液。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 方差分析

2.1.4 供試品溶液的制備

取土茯苓粉末（過四號篩）0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇30mL，超聲提取15min，提取3次，取出，放涼，濾過，用甲醇定容至100mL的容量瓶中，過0.45μm有機系濾膜，作為供試品溶液。

圖1 落新婦苷對照品色譜

圖2 供試品色譜

2.1.5 落新婦苷含量測定的方法學考察

標準曲線的制備。精密吸取落新婦苷對照品儲備液0.25mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，5.0mL 置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，備用。分別吸取上述系列溶液各10μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣，以落新婦苷濃度（μg·mL－1）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得到的回歸方程為：Y＝48125X＋5766.6（r＝0.9994）。其線性范圍為2.515～50.3μg·mL－1。

精密度實驗。吸取落新婦苷對照品溶液濃度為0.02012mg·mL－1，在上述色譜條件下重復進樣6次，測定峰面積，結(jié)果落新婦苷峰面積的RSD為1.22%，證明精密度良好。

重復性實驗。精密稱取土茯苓粉末6份，每份0.2g，按照“2.1.4”項下的方法制備供試品溶液，并在上述色譜條件下進行分析測定，結(jié)果顯示落新婦苷含量的RSD為2.1%，表明本方法的重復性良好。

穩(wěn)定性實驗。取同一供試品溶液，精密吸取10μL分別在0h，3h，6h，9h，12h各時間點進樣分析，測定得落新婦苷峰面積的RSD為0.75%，表明供試品在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

回收率實驗。精密稱取已知含量（落新婦苷含量為8.6512mg／g）的土茯苓粉末6份，每份0.1g，分別精密加入0.0503mg／mL的對照品溶液1mL。按“2.1.4”項下的方法制備供試液，以上述色譜條件進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

2.1.6 樣品測定

精密稱取各產(chǎn)地的土茯苓粉末，按照“2.1.4”項下方法制成供試品溶液。在上述色譜條件下進樣分析，測定峰面積，代入回歸方程，計算出落新婦苷含量，測定結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)110℃干燥至恒重的蘆丁對照品適量，加50%乙醇制成433μg·mL－1的蘆丁對照品溶液，作為對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取土茯苓粉末（過四號篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入石油醚50mL超聲提?。?00W，40KHz）30min，取出，棄去石油醚液，待樣品中殘存的石油醚全部揮去后，按表6正交實驗設(shè)計安排實驗，加規(guī)定量的乙醇溶液后稱定重量，超聲提取規(guī)定的時間，取出，放涼，稱重，用乙醇溶液補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液作為儲備液備用。

表6 總黃酮提取正交實驗因素與水平

2.2.3 測定波長的確定

取“2.2.1”項下蘆丁對照儲備液0.1mL，置于10mL容量瓶；加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加4%氫氧化鈉溶液4.0mL，再加50%乙醇定容，搖勻，放置10min。置于比色皿中，以試劑空白作為參比，在波長250～600nm之間測定紫外吸收光譜。同法測定樣品溶液在波長250～600nm之間紫外吸收光譜。根據(jù)對照品溶液和樣品溶液的紫外吸收光譜確定最佳的測定波長為500nm，見圖3。

圖3 紫外吸收光譜

2.2.4 顯色條件正交實驗

取“2.2.1”項下蘆丁對照儲備液0.1mL，置10mL容量瓶中，按表7正交實驗設(shè)計安排實驗。加規(guī)定量5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min；加規(guī)定量10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min；加規(guī)定量4%氫氧化鈉溶液，再加規(guī)定體積分數(shù)的乙醇定容，搖勻，放置10min。置于比色皿中，以空白試劑作為參比，在波長500nm處測定吸光度。

表7 顯色條件正交實驗因素與水平 （mL）

2.2.5 正交實驗結(jié)果分析

顯色條件。由表8中可知，影響吸光度的主次因素依次為：4%氫氧化鈉加入量＞5%亞硝酸鈉加入量＞乙醇體積分數(shù)＞10%硝酸鋁加入量，最佳的組合條件為A3B2C3D3，但綜合提取工藝的正交分析選擇A3B2C3D2為顯色條件，即加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，加10%硝酸鋁溶液0.3mL，加4%氫氧化鈉溶液4.0mL，再加50%乙醇定容。

超聲提取工藝的優(yōu)化。采用所建立的紫外分光光度法測定總黃酮含量，并以其為分析指標，進行超聲提取正交實驗，結(jié)果與分析見表9。從表9可知，影響總黃酮含量的主次因素依次為料液比＞乙醇體積分數(shù)＞超聲提取時間，其最佳工藝組合為A2B3C2，即用料液比為1∶50的50%乙醇在超聲波的條件下提取60min。

表8 顯色條件正交實驗結(jié)果與分析

綜上所得，樣品的前處理及測定方法：取土茯苓粉末（過四號篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入石油醚50mL超聲提取（500W，40kHz）30min，取出，棄去石油醚液，待樣品中殘存的石油醚全部揮去后，加50%乙醇溶液50mL后稱定重量，超聲提取60min，取出，放涼，稱重，用50%乙醇溶液補足減失的重量，濾過。取續(xù)濾液0.1mL，置10mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加4%氫氧化鈉溶液4mL，再加50%乙醇溶液定容，搖勻，放置10min。置于比色皿中，以空白試劑作為參比，在波長500nm處測定吸光度。

表9 超聲提取正交實驗結(jié)果與分析

2.2.6 總黃酮含量測定的方法學考察

標準曲線的制備。取“2.2.1”項下蘆丁對照儲備液0.05mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.25mL、2.5mL，分別置于10mL容量瓶中，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加4%氫氧化鈉溶液4.0mL，再加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10min。以空白試劑作為參比，在500nm波長處測定吸光度。以吸光度Y為縱坐標、濃度X為橫坐標繪制標準曲線，得其回歸方程為Y＝9.7028X－0.0169（r＝0.9999），其線性范圍為2.165～108.25μg·mL－1。

穩(wěn)定性實驗。精密稱取樣品約1g，按上述最佳提取工藝制備供試品溶液，依法顯色后測定吸光度，共測定2.5h，每0.5h一次，吸光度RSD＝3.00%（n＝6）。

精密度實驗。精密稱取樣品約1g，按上述最佳提取工藝制備供試品溶液，依法顯色后測定吸光度，共測定6次，吸光度RSD＝0.75%（n＝6）。

重復性實驗。精密稱取同一產(chǎn)地土茯苓粉末6份，每份1g，按上述最佳提取工藝制備供試品溶液，依法顯色后測定吸光度并計算含量，其含量的RSD＝3.66%（n＝6）。

2.2.7 樣品測定

分別精密稱取不同產(chǎn)地的土茯苓粉末（過四號篩）約1g，按上述最佳提取工藝制備供試品溶液，并依法顯色后在500nm波長處測定吸光度，代入標準曲線方程計算不同產(chǎn)地藥材的總黃酮含量，結(jié)果如表10。

表10 不同產(chǎn)地土茯苓中總黃酮的含量

3 討論

在總黃酮的顯色條件中選用80%乙醇溶液較佳，但與50%乙醇溶液的顯色效果接近。50%乙醇溶液對總黃酮的提取效果較理想，因此選用50%乙醇溶液作為提取溶劑。不同產(chǎn)土茯苓中落新婦苷與總黃酮的含量都有比較大的差異，其中廣東產(chǎn)的土茯苓中落新婦苷與總黃酮的含量均較高。本文利用正交試驗法對土茯苓中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，為科學評價該藥材質(zhì)量提供了依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：17.

［2］張白嘉，劉亞歐，劉榴，等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2004，20（1）：11－12.

［3］XU Q，WU FH，CAO JS，et al.Astilbin selectively induces dys－function of liver－infiltrating cells－novel protection from liverdamage［J］.Eur J Pharmacol，1999，377（1）：93－100.