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    揮發(fā)性有機物對大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞體外毒性的實驗研究

    2011-07-25 06:37:22張煥珠宋偉民
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2011年12期
    關(guān)鍵詞:星形甲苯膠質(zhì)

    張煥珠,宋偉民

    (上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心,上海 200126)

    揮發(fā)性有機化合物(VOCs)是指在常溫下,沸點50℃~260℃的各種有機化合物。VOCs按其化學結(jié)構(gòu),可以進一步分為烷類、芳烴類、酯類、醛類和其他等。目前已鑒定出的有300多種,最常見的有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷、二異氰酸酯(TDI)、二異氰甲苯酯等。VOCs是造成室內(nèi)空氣污染的主要原因之一。揮發(fā)性有機物為親脂性化合物,腦組織是其主要靶器官之一,而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外界危害因素極為敏感,當受到侵襲時常首先受累。星形膠質(zhì)細胞的作用不僅僅是支持和營養(yǎng)神經(jīng)元,還參與神經(jīng)元發(fā)育至神經(jīng)損傷的各種復雜過程。星形細胞培養(yǎng)具有細胞單一、觀察直接等優(yōu)點,已成為篩選神經(jīng)毒物,探索毒作用機制的重要方法[1-2]。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑和器材

    高糖型DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司),多聚-L-賴氨酸、胎牛血清(Hyclone公司),L-谷胺酰氨(上海伯奧生物科技有限公司),胰蛋白酶(上海華美生物有限公司),青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)、MTT,酶標儀,Beckman液體閃爍測定儀,超凈工作臺。CO2細胞培養(yǎng)箱(Napco,法國),倒置顯微鏡(Leica,德國),UnicoTM2000型分光光度計,6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板(Costar)。實驗動物:SD新生大鼠(1~3天齡),由上海醫(yī)科大學動物部提供。

    1.2 分離培養(yǎng)方法

    選取出生2d內(nèi)的正常SD仔鼠,頸動脈放血,取腦,將皮層組織移入D-Hank's液中,用吸管輕輕吹打,放置5min,取上清,進行離心(5min,1500轉(zhuǎn)/min)。棄上清,加入DMEM營養(yǎng)液(每升含6g葡萄糖,4mmol L-谷胺酰氨,10mM HEPES,1×105U青霉素,100mg鏈霉素,150mL胎牛血清),調(diào)整細胞濃度為1×106/mL,接種于培養(yǎng)瓶中,將此濃度細胞懸液接種于預(yù)先鋪好多聚-L-賴氨酸的培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育,以后每周換液2~3次。

    1.3 揮發(fā)性有機化合物儲備液處理

    將分析純試劑苯、甲醛、乙苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯配制成混合物(甲苯34.1%、乙苯19.5%、二甲苯31.7%、苯7.3%、苯乙烯7.4%、甲醛9.3%),調(diào)節(jié)溶液pH 值為6.0,0.25μm濾膜濾過除菌。

    1.4 MTT實驗

    MTT[32(4,52二甲基噻唑)22,52二甲基四唑溴鹽](Sigma)首先用 HBSS配制成5g/L的儲備液,0.25μm 濾膜濾過除菌,4℃避光可保存7天,使用前稀釋至所需工作液濃度。細胞培養(yǎng)3d,加入含不同揮發(fā)性有機物濃度的溶液,使終濃度為低濃度組(VOCs 3mmol/L),中濃度組(VOCs 6mmol/L),高濃度組(VOCs 9mmol/L)培養(yǎng)3d,每孔加入MTT15μL(115g/L),37℃孵育4h,棄去上清,每孔加入DMSO 100μL,室溫下放置10min,測定MTT光吸收值。按如下公式計算細胞活性:細胞活性(%)=OD暴露-OD空白/OD對照-OD空白。

    1.5 LDH實驗

    乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的測定將純化后的星形膠質(zhì)細胞每毫升約1.3×106的細胞數(shù),接種于24孔板中,培養(yǎng)3d后分組加入VOCs儲備液即對照組,使終濃度為對照組(VOCs 0mmol/L)、低 濃 度 組 (VOCs 3mmol/L)、中 濃 度 組 (VOCs 6mmol/L)、高濃度組(VOCs 9mmol/L)。培養(yǎng)72h后,吸取每孔板中的全部培養(yǎng)液,進行LDH活性(U/L)測定。

    2 結(jié)果

    2.1 形態(tài)學觀察

    與揮發(fā)性有機物共同培養(yǎng)24h后,細胞形態(tài)未見明顯異常,48h后細胞開始失去正常的形態(tài),變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形,細胞形態(tài)隨著染毒濃度增加改變加重,細胞也變得稀疏起來。

    2.2 MTT實驗

    從圖1中可以看出,隨著染毒濃度的增加,細胞活性隨之下降,在6mM和9mM組下降水平與對照組比較,有顯著性差異,P值分別<0.05和<0.01。

    圖1 VOCs暴露對細胞活性的影響

    2.3 LDH實驗

    圖2顯示了VOCs對星形膠質(zhì)細胞外乳酸脫氫酶的影響,可以看出,隨著染毒濃度的增加,細胞膜受損程度增加,細胞外乳酸脫氫酶含量增加,在9mm組達到顯著差異(P<0.01)。

    圖2 VOCs暴露對細胞外LDH含量的影響

    3 討論

    星形膠質(zhì)細胞是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時,最早和最顯著細胞反應(yīng)之一[3]。這種反應(yīng)表現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)的過度表達上。GFAP免疫反應(yīng)陽性細胞的增加不是由于星形膠質(zhì)細胞的增殖,而是每個星形細胞GFAP表達的增強。關(guān)于揮發(fā)性有機物中甲苯的神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究較多,在體外條件培養(yǎng)下,接觸甲苯的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞,均表現(xiàn)了酶活性的改變。甲苯抑制神經(jīng)突觸體和星形膠質(zhì)細胞膜的Na+,K+-ATP酶和 Mg2+-ATP酶活性,使膜脂流動性增加[4]。Engelke等[5]將大鼠腦皮層神經(jīng)細胞突觸體暴露于甲苯,結(jié)果ATP酶活性呈線性下降,在最高濃度組(8mmol),ATP酶活性下降了近50%,乙酰膽鹼脂酶活性也呈下降趨勢。也有研究發(fā)現(xiàn),星形細胞在體外接觸甲苯1h,Na+,K+-ATP酶活性輕度下降,與對照組比較無顯著性差異,而Mg2+-ATP酶活性明顯低于對照組,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.005)[6]。星形細胞是維持神經(jīng)元正常穩(wěn)態(tài)環(huán)境的細胞,細胞膜ATP酶起著重要作用。甲苯可通過酶的抑制作用而干擾星形細胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能,并對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生毒作用。大鼠暴露于甲苯,可使海馬、小腦以及齒狀回反應(yīng)性的神經(jīng)膠質(zhì)增加,GFAP表達增加[7-8],而在丘腦部位GFAP表達減少[9]。體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞急性暴露于甲苯,細胞凋亡增加,細胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶(MAPK)活性增加,可能是一種保護性反應(yīng)[10]。本次實驗結(jié)果表明,暴露于揮發(fā)性有機物,可對星形膠質(zhì)細胞的生長、形態(tài)造成一定損害,表現(xiàn)為細胞形態(tài)為多角形或不規(guī)則形,細胞較對照組稀疏,并隨濃度增加形態(tài)改變加重,從MTT實驗結(jié)果可以看出暴露于VOCs,細胞活力下降。本次實驗可以看到細胞外乳酸脫氫酶活力隨染毒濃度增加而升高,說明VOCs可以使星形膠質(zhì)細胞膜完整性受損。

    綜合本次實驗結(jié)果,VOCs可以對星形膠質(zhì)細胞造成毒性損害,從而影響星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、營養(yǎng)支持作用以及神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用,導致腦組織正常的結(jié)構(gòu)和功能改變,引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀。

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