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    骨樂寧膠囊對(duì)大鼠骨折模型VEGF的影響*

    2011-07-14 01:56:52任守平張榮位金鴻賓
    關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞空白對(duì)照切片

    任守平,張榮位,金鴻賓

    300211 天津醫(yī)院創(chuàng)傷中心(金鴻賓)

    如何促進(jìn)骨折愈合,防止骨折延遲愈合或骨不連的發(fā)生,是當(dāng)今骨科研究的重要課題之一。近年來隨著基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展,有關(guān)中藥促進(jìn)骨折愈合的研究工作取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[1],凸顯出中醫(yī)中藥辨證施治促進(jìn)骨折愈合優(yōu)勢(shì)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與骨折模型制作 4月齡Wister大鼠64只(合格證號(hào)SCXK津2009-0001),雌雄各半,平均體質(zhì)量為(230.00±37.35)g。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,然后用烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉,無菌操作,于右脛骨結(jié)節(jié)下2 mm處由前向后以磨鉆磨除脛骨前2/3骨質(zhì),僅保留髓腔后側(cè)皮質(zhì)骨,形成約3 mm×4 mm近橫斷骨缺損區(qū)造模,術(shù)后腹腔注射硫酸慶大霉素2天以預(yù)防感染。標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)(由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供),自由攝食、飲水。

    1.2 治療藥物 骨樂寧膠囊:當(dāng)歸、黃芪、熟地黃、白芍、川芎、柴胡、赤芍、桃仁、紅花等組成。由天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)院制劑科制作提供。每粒含生藥0.3g。

    骨折挫傷膠囊:哈爾濱華雨制藥有限公司生產(chǎn)中成藥,批號(hào)ZZ-5434-黑衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1989)第300127號(hào)。主要成份有:紅花、大黃、當(dāng)歸、乳香、沒藥、血竭、土鱉蟲、自然銅等。每粒含生藥0.29g。

    1.3 分組治療與標(biāo)本采集 造模后的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組:骨樂寧高劑量組、骨樂寧低劑量組、骨折挫傷膠囊組、空白對(duì)照組,每組16只。按人與大鼠體質(zhì)量換算系數(shù)5.1計(jì)算,骨樂寧高劑量組用量為0.55mg/(g·d),骨樂寧低劑量組為0.30 mg/(g·d),骨折挫傷膠囊劑量為0.46 mg/(g·d)。造模術(shù)后第1天起按上述用藥量的蒸餾水混懸液灌胃給藥,每日1次;空白對(duì)照組給予等容量生理鹽水灌胃。

    全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于治療 7、14、21、28 d 時(shí),分4批拉頸處死,截取模型骨段,剔除脛骨周圍軟組織,20%中性福爾馬林液固定24 h,再經(jīng)脫水、脫鈣、切片、染色后觀察。

    1.4 檢測(cè)方法 采用卵白素—生物素復(fù)合技術(shù)進(jìn)行免疫組化染色顯示血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)陽性細(xì)胞。嚴(yán)格按照試劑盒(上海西唐生物技術(shù)公司)說明要求操作,石蠟切片脫蠟至水后,3%雙氧水(H2O2)消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,再行抗原熱修復(fù),正常山羊血清封閉。滴加一抗、二抗等多重孵育,最后用二甲氨偶氮苯(DAB)顯色劑顯色,復(fù)染,封片。每骨切片在400倍鏡下取5個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的陽性染色細(xì)胞數(shù),再取其平均數(shù)作為個(gè)體陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)并以Image-Pro圖像處理系統(tǒng)計(jì)算其染色面積。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行判斷,P<0.05,P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)。

    2 結(jié)果

    骨折模型在不同時(shí)點(diǎn)骨痂中VEGF的表達(dá)。染色結(jié)果顯示在骨小梁及成骨細(xì)胞中著色,細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒樣改變,而細(xì)胞核呈淡藍(lán)色,深棕黃色者為強(qiáng)陽性,淺黃色者為弱陽性,無著色顆粒者為陰性??梢钥闯鯲EGF在傷后第7天時(shí)即已有表達(dá),但僅在少數(shù)成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中;第14天時(shí)達(dá)到峰值,在血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞均為強(qiáng)陽性表達(dá),第28天時(shí)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯減少。這一過程在相應(yīng)的陽性細(xì)胞染色面積統(tǒng)計(jì)上表現(xiàn)得更為突出,且與相關(guān)研究具有一致性[2-3]。總體在4個(gè)檢測(cè)時(shí)點(diǎn)的骨痂切片中骨樂寧膠囊高劑量組VEGF表達(dá)較其他各組強(qiáng),空白對(duì)照組表達(dá)最弱,見表1和表2。

    表1 骨痂切片VEGF染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s) 個(gè)/視野

    表1 骨痂切片VEGF染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s) 個(gè)/視野

    注:與空白組比較:*P<0.05,**P<0.01,與骨折挫傷組比較:#P<0.05。

    組別 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨樂寧高 15 32.90±3.4 59.20±5.5**50.00±3.1*# 27.50±0.3骨樂寧低 16 27.10±2.9 43.70±3.0 39.50±4.2 22.70±1.9骨折挫傷 16 29.20±4.2 48.80±1.7* 36.80±4.3 21.80±2.2空白對(duì)照 14 22.20±3.0 36.80±2.5 34.00±3.9 20.90±2.6

    3 討論

    人體氣血循行于周身,外而營(yíng)養(yǎng)皮肉筋骨,內(nèi)而灌溉五臟六腑。故當(dāng)肢體受跌撲打擊外傷之時(shí),皮肉筋骨雖首當(dāng)其沖的同時(shí)必然傷及氣血,外而為腫為痛,內(nèi)而臟腑功能失調(diào)。正如《正體類要》序中所指出“肢體損傷于外則氣血傷于內(nèi),營(yíng)衛(wèi)有所不貫,臟腑由之不和”。血瘀氣滯所致的傷處腫痛實(shí)乃外傷之標(biāo),而氣血臟腑功能失和才是傷病之本。治療則需氣血標(biāo)本兼顧。有實(shí)驗(yàn)研究證明中藥在骨折愈合的不同階段有著不同的作用及機(jī)制,過多使用活血化瘀藥可破壞骨折愈合自身相對(duì)穩(wěn)定的血氧代償機(jī)制,不利于新生血管的形成從而影響骨折愈合。骨樂寧膠囊立方旨在通過益氣活血以達(dá)到瘀去新生促進(jìn)骨折愈合的目的。

    表2 骨痂切片VEGF染色陽性細(xì)胞面積(±s)

    表2 骨痂切片VEGF染色陽性細(xì)胞面積(±s)

    注:與空白組比較:*P<0.05,**P<0.01,與骨折挫傷組比較:#P<0.05,##P<0.01。

    ×10-10m2/視野組別 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨樂寧高 15 131.5±23.4**205.6±30.2**##174.6±18.2*#91.7± 9.6骨樂寧低 16 110.8±11.7 145.9±21.4 135.9± 9.7 78.9±14.1骨折挫傷 16 118.5±17.3* 159.9±14.3* 129.7±12.5 74.6±12.1空白對(duì)照 14 86.3±14.8 125.1±23.4 116.5±14.4 70.3±11.8

    [1]任守平,金鴻賓.中藥對(duì)骨折愈合相關(guān)細(xì)胞因子作用的研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥,2010,26(6):527-529.

    [2]初同偉,王正國(guó),朱佩芳,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在骨折愈合中的作用[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2002,16(2):75.

    [3]任守平,金鴻賓.骨樂寧膠囊早期促進(jìn)骨折愈合的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥,2010,26(4):323-324.

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