自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對心肌梗死后心衰家兔炎性因子表達(dá)的影響

喬建晶 李樹仁 胡 煒 王天紅 劉東霞 荀麗穎 郝淸卿 吳 迪 董 潔 齊曉勇

(河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

急性心肌梗死(AMI)往往伴隨強烈的免疫炎癥反應(yīng)，是損傷部位修復(fù)機制的重要調(diào)控因素之一。免疫炎癥反應(yīng)過度激活將導(dǎo)致心肌進一步損傷，推動心室重塑的發(fā)生和發(fā)展〔1〕。多種抗炎藥物已被用于AMI治療，但臨床研究尚未達(dá)到預(yù)期療效。采用甲潑尼龍抑制心肌梗死后炎癥反應(yīng)，但患者心律失常發(fā)生率增加，梗死面積擴大，甚至增加心臟破裂的發(fā)生率。非甾體類抗炎藥物治療AMI的相關(guān)研究也與預(yù)期不符。兩項大的臨床試驗RENAISSANCE和RECOVER結(jié)果顯示:重組TNF受體融合蛋白依那西普(Etanercept)對心力衰竭患者的住院率和病死率無明顯改善。實驗研究顯示BMSCs移植可以抑制AMI后免疫炎癥反應(yīng)，延緩心肌梗死后心室重塑〔2，3〕，可能與調(diào)節(jié)相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。本實驗觀察BMSCs移植對心肌梗死后心衰家兔炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以揭示其治療心肌梗死的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號:SCXK冀2008-1-003)5月齡健康雄性新西蘭白兔34只，體重1.8～2.3 kg，隨機分為假手術(shù)組、AMI后心衰模型組、BMSCs移植組。組間體重?zé)o顯著差異。

1.2 主要試劑 胎牛血清(美國hyclone公司);低糖DMEM培養(yǎng)基(美國 hyclone公司);Percoll原液(美國Pharmacia公司);DAPI(瑞士Roche公司);5-氮胞苷(美國SIGMA公司)。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)及標(biāo)記 在股骨處穿刺抽取3～5 ml骨髓，用Percoll分離液(密度1.073 g/ml)分離骨髓單個核細(xì)胞，將分離的細(xì)胞懸液置于含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃，5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。3～5 d首次換液，以后每3或4天換液1次，14～21 d細(xì)胞生長融合80%以上后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。于移植前1天用含5-氮胞苷(10μmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。移植前 2 h用含二脒基苯基吲哚(DAPI)(濃度50μg/ml)標(biāo)記培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。最后收集1×107BMSCs，用DMEM濃縮至1 ml，置于冰上(不超過1 h)，移植備用。

1.4 兔AMI后心衰模型的建立 稱重后，兔仰臥于手術(shù)臺，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉，剪除胸毛、消毒鋪無菌洞巾，沿胸骨正中線第2，3肋間稍偏左做長約3 cm切口，分離肋間肌、剪斷肋骨、剪開心包暴露心臟，用6/0醫(yī)用無損傷縫線穿過左冠狀動脈前降支深部，小心打結(jié)并觀察心電圖動態(tài)變化。心電圖可見相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，同時肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域心肌變白為結(jié)扎成功，逐層關(guān)胸，縫合切口。術(shù)后3 d肌注青霉素80萬U預(yù)防感染。術(shù)前及術(shù)后2 h記錄體表心電圖。1.5 細(xì)胞移植 AMI術(shù)后14 d，仍以3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈麻醉兔二次開胸，再次行胸骨左側(cè)切口打開胸腔，暴露心臟，選取心肌梗死周邊區(qū)域4個注射點，BMSCs組注射BMSCs懸液，AMI后心衰模型組注射 PBS液。每點注射0.25 ml，注射位置以6/0手術(shù)線標(biāo)記。術(shù)后獨籠精心飼養(yǎng)。

1.6 超聲心動圖左心功能測定 采用美國惠普公司5500型彩色多普勒超聲心動圖儀在術(shù)前、心梗后7 d、細(xì)胞移植后28 d分別由同一?？漆t(yī)生進行超聲心動圖檢測。重點測算左室舒張末內(nèi)徑(EDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)，取3次測量平均值，由超聲心動圖醫(yī)生進行操作。

1.7 取材 各組動物飼養(yǎng)至細(xì)胞移植后4 w，在全身麻醉下再次開胸，心內(nèi)注射10%氯化鉀2 ml使心臟停搏于舒張期，迅速取下心臟，冰鹽水沖洗干凈，在相應(yīng)梗死周邊區(qū)切取標(biāo)本，置入液氮罐冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 ELISA法測血清炎性因子 分別于術(shù)前、心梗后7 d、細(xì)胞移植后28 d(處死前)經(jīng)耳緣靜脈抽血2～3 ml，避免溶血，抗凝劑用EDTA，2 000 r/min離心8 min，取上清－20℃保存，采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α、CRP的濃度。試劑盒由美國ADL公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.9 實時定量PCR法檢測心肌組織NF-κB、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá) 將心肌組織按RNA試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)說明書提取RNA。42℃反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄試劑盒:Promega，USA)50 min，95℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。Syber Green熒光定量PCR檢測(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits，ABI)。儀器型號:ABI 7300 Real-Time PCR System，美國ABI公司。PCR熱循環(huán)參數(shù):96℃ 4 min，然后三步反應(yīng):94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，40個循環(huán)，于每個循環(huán)的第3步即:72℃ 30 s收集熒光信號。實時熒光定量PCR結(jié)果分析:擴增完畢后，進入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達(dá)的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計分析。引物序列:兔 NF-κB，121 bp，上游引物 5'-TACGGCTTCCCACACTATGG-3'，下游引物 5'-TCACAACATCCAGGGTCAGT-3';兔 IL-6，79 bp，上游引物 5'-GCCTGCTGAGAATCACTTCG-3'，下游引物5'-TCGTCACTCCTGAACTTGGC-3';兔 TNF-α，148 bp，上游引物5'-AGTAGCAAACCCGCAAGTG-3'， 下 游 引 物 5'-GCTGAAGAGAACCTGGGAGT-3';兔 GAPDH，92 bp，上游引物 5'-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下 游 引 物 5'-CACTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包，計量資料以x±s表示。多組資料之間的比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)對比采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察 大部分BMSCs于12 h貼壁，72 h可見貼壁生長以分散、克隆集落方式增殖，少量細(xì)胞拉長呈紡錘形緊貼培養(yǎng)瓶底部生長繁殖。5～7 d后細(xì)胞開始快速增殖，集落逐漸增大。11～14 d細(xì)胞集落間出現(xiàn)相互融合，細(xì)胞鋪滿單層，呈旋渦狀排列。大部分呈長梭形，少數(shù)三角形、多角形。密集處中心的細(xì)胞由多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮巍０溯^大，多為卵圓形，也有圓形、不規(guī)則形，其中可見處于分裂期的核仁，胞體肥大，胞質(zhì)豐富，大多數(shù)細(xì)胞有偽足。見圖1。

2.2 熒光顯微鏡下觀察DAPI標(biāo)記的BMSCs 經(jīng)DAPI標(biāo)記2 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到DAPI標(biāo)記的BMSCs。細(xì)胞移植28 d后，處死家兔后，取梗死周邊區(qū)域心肌組織，經(jīng)冰凍切片機切片后，在熒光顯微鏡下可觀察到的經(jīng)DAPI標(biāo)記的移植BMSCs。見圖 2。

2.3 家兔心功能檢測結(jié)果 術(shù)前各組EDD、EF、FS均無顯著差異。AMI后心衰模型制作7 d，AMI后心衰模型組、BMSCs組EF值比正常對照組顯著降低(P＜0.05);AMI后心衰模型組和BMSCs組EF值差異不顯著。細(xì)胞移植后28 d，正常對照組、BMSCs組EDD均明顯低于AMI后心衰模型組(P＜0.05)，EF及FS均明顯高于AMI后心衰模型組(P＜0.05)。差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.4 血清炎性因子檢測結(jié)果 術(shù)前各組炎性因子無顯著差異。術(shù)后7 d，與正常對照組相比AMI后心衰模型組、BMSCs組的血清 IL-6、TNF-α、CRP的濃度均顯著增加(P ＜0.05)，但AMI后心衰模型組和BMSCs組之間差異不顯著。細(xì)胞移植后28 d，BMSCs組血清 IL-6、TNF-α、CRP 的濃度比 AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05);正常對照組略低于BMSCs組，但無顯著差異。見表2。

2.5 心肌組織炎性因子PCR檢測結(jié)果 細(xì)胞移植后28 d，BMSCs組梗死邊緣區(qū)心肌組織IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)比AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05)。見表3。

2.6 心肌組織NF-κB的PCR檢測結(jié)果 與正常組相比AMI后心衰模型組、BMSCs組的心肌梗死邊緣區(qū)的NF-κB均顯著增加(P＜0.05)，BMSCs組比AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05)。見表3。

表1 兔心功能測定(x ± s，n=8)

表2 兔血清炎性因子測定結(jié)果(x ± s，n=8)

表3 兔移植28 d心肌組織炎性因子PCR檢測RQ值(x ± s，n=8)

圖1 BMSCs 20 d(×200)

圖2 DAPI標(biāo)記后2 h及細(xì)胞移植28 d后心肌組織BMSCs

2.7 心功能與心肌組織炎性因子及NF-кB的相關(guān)性 細(xì)胞移植后28 d時，EF與血清炎性因子呈負(fù)相關(guān)(CRP:r=－0.605，P=0.002，Y=93.959 －4.344X;TNF-α:r= －0.425，P=0.039，Y=85.346－0.122X;IL-6:r= －0.475，P=0.025，Y=86.967 －0.085X);與心肌組織炎性因子呈負(fù)相關(guān)(TNF-α:r=－0.592，P=0.002，Y=71.206 － 2.887X;IL-6:r= －0.512，P=0.011，Y=70.392－1.509X);與心肌組織 NF-κB呈負(fù)相關(guān)(r=－0.866，P=0.001，Y=71.621－10.039X)。其中 Y 代表 LVEF值，X代表各個炎性因子。

3 討論

骨髓干細(xì)胞用于心肌梗死治療研究已經(jīng)成為心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點。動物研究幾乎一致顯示骨髓干細(xì)胞可以明顯改善梗死心臟心功能，抑制心室重塑〔4，5〕，相關(guān)的臨床研究也得到了類似的結(jié)果〔6〕。但由于目前臨床研究的樣本量較小，另外無法完全做到隨機對照，再加上目前干細(xì)胞治療心肌梗死的確切機制并不清楚，因此骨髓干細(xì)胞到底能否治療心肌梗死尚未得到完全肯定。目前認(rèn)為其機制可能與心肌和血管再生、抑制心肌細(xì)胞凋亡以及旁分泌機制有關(guān)〔7〕。BMSCs治療AMI的機制較復(fù)雜，除了目前的幾種機制外，可能存在有其他未知機制。本研究結(jié)果顯示:BMSCs移植可以抑制NF-κB表達(dá)，下調(diào)炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和CRP)的表達(dá)，可以明顯改善心肌梗死后心功能，延緩心肌梗死后向心力衰竭方向的進展。BMSCs具有獨特的免疫學(xué)特性，移植到機體后可以調(diào)節(jié)受體的免疫炎癥反應(yīng)〔8〕。由于心肌梗死后伴隨的免疫炎癥反應(yīng)在隨后的梗死后心室重構(gòu)過程中起著重要的推動作用〔9〕。故可以認(rèn)為心肌梗死后減輕免疫炎癥反應(yīng)可以抑制心室重構(gòu)，改善心功能。心肌梗死后伴隨一定程度的免疫炎癥反應(yīng)，而且免疫炎癥反應(yīng)在心室重構(gòu)進展中起著重要的推動作用，心肌梗死后調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)可能成為抑制心室重塑的新靶點。NF-κB是與炎癥反應(yīng)有關(guān)的即早基因的表達(dá)調(diào)控關(guān)鍵因子之一。NF-κB與抑制蛋白I-κB結(jié)合在胞漿中呈非活化狀態(tài)，在刺激因子作用下，與I-κB解離而活化，并迅速核移位，與特異性κB結(jié)合而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，分泌白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞黏附分子、干擾素等炎性介質(zhì)，產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)。NF-κB能在轉(zhuǎn)錄水平激活炎性細(xì)胞因子，而某些細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6又可進一步激活 NF-κB，如此循環(huán)產(chǎn)生放大作用〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植后，可顯著降低梗死邊緣區(qū)NF-κB的表達(dá)，進而調(diào)控炎癥反應(yīng)有關(guān)的即早基因的表達(dá)，下調(diào)了炎性因子TNF-α、IL-6和CRP的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)對心肌的損傷，從而減輕心肌梗死后心室重塑。

TNF-α和IL-6作為促炎細(xì)胞因子對心肌細(xì)胞具有毒性作用，可以抑制心肌收縮功能，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，推動心室重構(gòu)的進展〔11〕。正常心肌組織很少表達(dá)TNF-α和IL-6，而心肌缺血損傷可迅速激發(fā)TNF-α和IL-6的高水平表達(dá)。動物實驗也證實抑制TNF-α的活性可以明顯減小心肌梗死面積，改善心功能〔12〕。因此，抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)有助于延緩心肌梗死后心室重構(gòu)。本實驗結(jié)果顯示細(xì)胞移植后4 w時，AMI后心衰模型組促炎因子TNF-α和IL-6在梗死區(qū)存活心肌內(nèi)表達(dá)明顯增加，而BMSCs移植組明顯降低促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。從而在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，延緩心肌梗死后家兔心室重塑，延緩向心力衰竭的發(fā)展。

CRP是由白細(xì)胞介素-6及TNF等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的在肝臟合成的一種急性時相反應(yīng)蛋白。機體在感染、組織損傷等應(yīng)激情況下會產(chǎn)生急性時相反應(yīng)，此時IL-6，TNF等細(xì)胞因子分泌增多，肝臟合成的CRP明顯增加。CRP在正常人群含量極低，其水平增高被認(rèn)為機體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。采用高靈敏度的系統(tǒng)來檢測CRP已經(jīng)被多項前瞻性研究證實是未來發(fā)生心血管事件的預(yù)測指標(biāo)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以減少CRP的合成，減輕炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果提示BMSCs可能通過抑制NF-κB活性而下調(diào)炎性細(xì)胞因子(CRP、TNF-α和 IL-6)表達(dá)，從而也阻斷了NF-κB與炎性細(xì)胞因子的相互激活和促進，從而減輕炎癥反應(yīng)，減輕心肌梗死后左室重塑，延緩心肌梗死后向心力衰竭的進展。因此作者推測BMSCs治療心肌梗死可能部分歸功于免疫炎癥調(diào)節(jié)機制，BMSCs移植有望成為心肌梗死后免疫調(diào)節(jié)治療的策略之一。

BMSCs移植后通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用〔13〕。BMSCs表達(dá)的表面分子可以與T細(xì)胞發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生物活性，通過這種免疫調(diào)節(jié)作用，一方面可以逃避免疫反應(yīng)對其自身的破壞，另一方面也可以減輕周圍組織中的免疫反應(yīng)強度，從而在一定程度上保護組織功能。BMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用機制復(fù)雜，可能與多種因素有關(guān)〔14〕。(1)本身低免疫原性，MSCs表達(dá)中等水平的MHC-Ⅰ類分子，從而能被NK細(xì)胞赦免;不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，故能逃避異原性CD4+T細(xì)胞的識別。同時它不表達(dá)FAS配體或共刺激分子，因而不能誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng);(2)通過分泌可溶性細(xì)胞因子(如肝細(xì)胞生長因子和TGF-α)，與T細(xì)胞直接接觸誘導(dǎo)T細(xì)胞活化受阻;通過PGE2和吲哚胺2，3雙加氧酶介導(dǎo)活化NK細(xì)胞增殖受抑〔15〕;(3)改變T細(xì)胞和DC的表型、功能，研究發(fā)現(xiàn)MLR中加入BMSCs后Treg明顯增加;人BMSCs通過細(xì)胞間接觸可將APC轉(zhuǎn)化為半成熟的抑制型DC而誘導(dǎo)外周耐受。另外BMSCs在體外能明顯抑制CD8+T細(xì)胞增殖，同時減低Thl而增加Th2。

由于骨髓干細(xì)胞移植可能通過定向分化、融合、旁分泌、抑制免疫炎癥反應(yīng)等作用方式影響梗死區(qū)心肌再生和血管形成，因而是一種有前途的研究方向。到目前為止，國內(nèi)外研究由于移植的細(xì)胞類型，途徑，病例數(shù)，無嚴(yán)格對照，隨訪時間少等諸多原因目前仍存在許多尚待解決的問題。比如是否需要采用動員方案及最佳動員時機，移植細(xì)胞是否需要純化，細(xì)胞移植的最佳時間點，最佳移植途徑，最佳移植數(shù)量，以及是否存在成瘤現(xiàn)象;缺乏干細(xì)胞治療的長期資料，細(xì)胞移植治療的具體機制等。另外，植入缺血心肌內(nèi)的BMSCs生存能力差，這也大大限制了它們的修復(fù)能力。怎樣有效提高移植細(xì)胞的存活，還需繼續(xù)努力研究和探索。這些問題都需要我們在進一步的研究實踐中逐漸解決。隨著科技的發(fā)展和社會的進步，細(xì)胞移植無疑對缺血性心臟病的治療提供了新的手段，并將會產(chǎn)生廣闊的應(yīng)用前景。

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