柱后衍生化高效液相色譜法測(cè)定門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸顆粒劑的有關(guān)物質(zhì)及含量*

覃婷婷，韓曉捷，黃哲甦

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸顆粒在臨床上適用于急、慢性肝病包括肝硬化、脂肪肝、各型病毒性和中毒性肝炎以及高血氨癥，特別是因肝臟疾病所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的改善及肝性腦病的救治[1]。門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸本身紫外吸收較弱，其含量通常采用氨基柱HPLC法通過(guò)末端吸收測(cè)定[2]，或是采用柱前衍生HPLC法[3]測(cè)定，這兩種方法對(duì)于制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢查均不太適合，前者靈敏度較差，后者衍生試劑干擾較大，且衍生后產(chǎn)物不穩(wěn)定，影響準(zhǔn)確性?！兜聡?guó)藥典》2008年版對(duì)收載的門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸原料規(guī)定用TLC法檢查有關(guān)物質(zhì)，但是該方法靈敏度不高，無(wú)法準(zhǔn)確定量。鑒于此，本文嘗試建立了柱后衍生的方法測(cè)定門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的有關(guān)物質(zhì)，一方面將提高響應(yīng)值，另一方面，由于柱后衍生反應(yīng)時(shí)間較短，減少了過(guò)多雜質(zhì)的生成，且消除了衍生試劑的干擾，故而具有方便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 儀器與試藥

LC-2010AHT系列液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，PINNACLE PCX柱后衍生儀(Pickering公司)；門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸顆粒(國(guó)外某企業(yè)，批號(hào)005271、612111、709811)；對(duì)照品：門(mén)冬氨酸、鹽酸鳥(niǎo)氨酸、鹽酸鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺、賴氨酸和Ω-二鳥(niǎo)氨酸(國(guó)外某企業(yè)，批號(hào)分別為BCBC7841、035K05791、ED 12/07、1352773、ED 05/04)；辛烷磺酸鈉為HPLC專(zhuān)用試劑(山東禹王)；乙腈為色譜純(天津康科得)；鄰苯二甲醛(J&K公司)；巰基丙酸(Alfa Aesar)；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1有關(guān)物質(zhì)檢查方法

2.1.1色譜條件 色譜柱：Synergi Hydro RP(150 mm×3 mm, 4 μm)；流動(dòng)相A：取1.08 g辛烷磺酸鈉溶于1 000 ml水中，加1.6 ml高氯酸；流動(dòng)相B：取1.08 g辛烷磺酸鈉溶于500 ml水中，加500 ml乙腈混勻，再加1.6 ml高氯酸，采用梯度程序洗脫，見(jiàn)表1；流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)336 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μl。衍生條件溫度80 ℃，衍生試劑流速0.6 ml/min。

表1 有關(guān)物質(zhì)程序洗脫條件

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1供試品溶液的制備 取本品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸1.5 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.1.2.2對(duì)照品溶液的制備 分別稱(chēng)取門(mén)冬氨酸和鹽酸鳥(niǎo)氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸7.5 μg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2.3系統(tǒng)適用性溶液的制備 分別稱(chēng)取門(mén)冬氨酸、鹽酸鳥(niǎo)氨酸、鹽酸鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺、賴氨酸和Ω-二鳥(niǎo)氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中分別含門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸0.75 mg，含鳥(niǎo)氨酰內(nèi)酰胺、賴氨酸和Ω-二鳥(niǎo)氨酸7.5 μg的溶液，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.1.2.4陰性對(duì)照溶液的制備 按處方制備不含門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的陰性樣品，并按供試品溶液的制法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取系統(tǒng)適用性溶液，進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下門(mén)冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸與3種雜質(zhì)分離度均大于1.5，陰性對(duì)照在主成分和雜質(zhì)相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾。各峰的分離度和保留時(shí)間見(jiàn)表2，典型分離圖見(jiàn)圖1。

2.1.4線性考查 精密稱(chēng)取門(mén)冬氨酸和鹽酸鳥(niǎo)氨酸對(duì)照品適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液配成相當(dāng)于有關(guān)物質(zhì)檢查用對(duì)照品溶液的50%、80%、100%、120%和150%濃度的5種溶液，各取20 μl分別注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到線性方程。門(mén)冬氨酸回歸方程為：Y= 42 005X-22 901(r=0.999 6)，鳥(niǎo)氨酸回歸方程為:Y= 78 041X-38 513(r= 0.999 8)。結(jié)果表明，在3.75～11.25 μg/ml范圍內(nèi)門(mén)冬氨酸與鳥(niǎo)氨酸溶液濃度均與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.門(mén)冬氨酸 2.鳥(niǎo)氨酸 3.鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺 4.賴氨酸 5.Ω-二鳥(niǎo)氨酸

2.1.5校正因子的測(cè)定 精密稱(chēng)取鹽酸鳥(niǎo)氨酸和鹽酸鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺對(duì)照品適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液配成每1 ml各分別含4、6、8、10和12 μg的5種溶液，取20 μl分別注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到線性方程，以鳥(niǎo)氨酸與鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺的斜率之比作為鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺雜質(zhì)的校正因子，測(cè)得結(jié)果為1.851 9。

2.1.6檢出限 取“2.1.4”項(xiàng)下的100%濃度溶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋制備不同濃度的溶液，在選定的色譜條件下，按信噪比為3對(duì)最低檢測(cè)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸的檢出限均為5 ng。

2.1.7溶液的穩(wěn)定性 取配制后的供試品溶液分別于0、2、4和8 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，放置4 h后，鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺和未知雜質(zhì)峰峰面積隨放置時(shí)間而增高，表明該溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 取本品3批(批號(hào)005271、612111、709811)分別按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖，按外標(biāo)法加校正因子以峰面積計(jì)算,鳥(niǎo)氨酸內(nèi)酰胺含量按鳥(niǎo)氨酸峰面積計(jì)算分別為0.06%、0.08%和0.05%，其他未知雜質(zhì)的含量，按門(mén)冬氨酸峰計(jì)算分別為0.09%、0.05%和0。

2．2含量測(cè)定方法

2.2.1色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，程序洗脫條件見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定程序洗脫條件

2.2.2溶液配制

2.2.2.1對(duì)照品溶液 分別稱(chēng)取門(mén)冬氨酸和鹽酸鳥(niǎo)氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸0.075 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2.2供試品溶液 取本品10包，研細(xì)后精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸0.15 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方制備不含門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的陰性樣品，并按供試品溶液的制法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.3專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μl進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液中門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸分別在3 min和15.5 min左右出峰，而供試品溶液在相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照溶液在此處無(wú)峰，表明處方中其他成分對(duì)主成分含量的測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.2.4線性考查 考查了相當(dāng)于含量測(cè)定用對(duì)照品溶液的50%～150%范圍內(nèi)的線性關(guān)系。門(mén)冬氨酸回歸方程為:Y= 37 184X- 2 606(r=0.999 8)；鳥(niǎo)氨酸回歸方程為:Y= 78 062X- 108 174(r=0.999 9)。結(jié)果表明，在37.5～112.5 μg/ml范圍內(nèi)門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸溶液濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

1.門(mén)冬氨酸 2.鳥(niǎo)氨酸

2.2.5回收率試驗(yàn) 分別取門(mén)冬氨酸對(duì)照品60、75和90 mg和鹽酸鳥(niǎo)氨酸對(duì)照品75、96和115 mg各3份，精密稱(chēng)定，分別置100 ml量瓶中，按處方量分別加入輔料，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 ml至10 ml量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，依法測(cè)定并計(jì)算門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸的回收率，門(mén)冬氨酸回收率(n=9)為101.2%，RSD為0.92%；鳥(niǎo)氨酸回收率(n=9)為101.0%，RSD為0.97%。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.6重復(fù)性考查 取同一批樣品，同法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定含量，其平均含量為102.1%，RSD為0.41%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7供試品溶液的穩(wěn)定性 取配制后的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12和24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。門(mén)冬氨酸峰面積RSD為0.94%(n=8),鳥(niǎo)氨酸峰面積RSD為0.76%(n=8)，結(jié)果表明，供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8含量測(cè)定 取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl進(jìn)樣,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。結(jié)果3批樣品(批號(hào)005271、612111、709811)的含量為102.5%、96.8%和98.9%，均符合規(guī)定。

表4 門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1色譜柱的選擇 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾分別試驗(yàn)過(guò)Kromasil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,)、Agilent SB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)等常規(guī)規(guī)格的色譜柱，但分離效能均沒(méi)有Synergi Hydro RP(150 mm×3 mm, 4 μm)色譜柱效果好。但是該柱因?yàn)閮?nèi)徑小，所以柱壓高，會(huì)縮短色譜柱壽命，并且不易獲得，因此在滿足分離條件的前提下可以考慮用常規(guī)色譜柱代替。

3.2關(guān)于有關(guān)物質(zhì)檢查方法的建議 考慮到雜質(zhì)對(duì)照品較難獲得，采用加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法來(lái)測(cè)定已知雜質(zhì)，可減少雜質(zhì)對(duì)照品的使用量，盡量降低分析的成本。

3.3關(guān)于含量測(cè)定計(jì)算的討論 門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸衍生后經(jīng)色譜柱分離為門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸兩個(gè)峰，在以前有的計(jì)算方法是將二者的峰面積加和計(jì)算的，筆者在本實(shí)驗(yàn)中是分別計(jì)算出門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸的含量后，再分別折合成門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的含量，然后取二者的平均值作為測(cè)定的結(jié)果。建議折合后的含量應(yīng)計(jì)算相對(duì)平均偏差(RAD)，將其控制在2%以內(nèi)，以此保證樣品中門(mén)冬氨酸與鳥(niǎo)氨酸的摩爾比接近理論值1∶1，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本法與薄層色譜法、柱前衍生化HPLC法比較，具有靈敏度高、準(zhǔn)確檢測(cè)制劑中雜質(zhì)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于測(cè)定門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸顆粒劑中的有關(guān)物質(zhì)及含量。

1 蔣音, 陳良, 巫善明. 門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的藥理作用與臨床應(yīng)用. 世界感染雜志, 2007, 7(5): 415

2 繆寧梅, 馬婕. 高效液相色譜法測(cè)定門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸注射液的含量. 中國(guó)生化藥物雜志, 2007, 28(1): 52

3 張莉, 黃哲蘇, 李海生. 異硫氰酸苯酯柱前衍生法測(cè)定門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸注射液含量. 藥物分析雜志, 2008, 28(7): 1174