牛黃化毒片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉 冰，王 佳，苗淑杰

( 1.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070； 2.天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300385 )

牛黃化毒片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊(cè)》，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為WS3-B-3567-98。該藥是由天南星(制)、連翹、金銀花、白芷、甘草、乳香、沒(méi)藥、人工牛黃8味藥材組成，有解毒消腫，散結(jié)止痛的功效，可以用于瘡瘍、乳癰、紅腫疼痛的治療?，F(xiàn)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀及綠原酸的薄層色譜鑒別和檢查項(xiàng)，而其中白芷具有祛風(fēng)濕，活血排膿，生肌止痛的功效。為有效地控制藥品質(zhì)量，本文增加了連翹、甘草和人工牛黃的薄層鑒別方法，及白芷中歐前胡素的含量測(cè)定方法。修訂后的標(biāo)準(zhǔn)可用于牛黃化毒片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、DAD檢測(cè)器、Chem Stations色譜工作站)。連翹對(duì)照藥材(批號(hào)120908-200613)、甘草對(duì)照藥材(批號(hào)120904-200512)、膽酸對(duì)照品(批號(hào)100078-200414) 、豬去氧膽酸對(duì)照品(批號(hào)100087-200610)和歐前胡素對(duì)照品(批號(hào)為110826-200712，供含量測(cè)定用，含量99.9%)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，水為去離子水。高效硅膠G薄層板(山東煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)070316)。牛黃化毒片樣品(天津市同仁堂股份有限公司提供，批號(hào)為584004、783001、788002、889002)。

2 薄層色譜鑒別

2.1連翹的鑒別

2．1．1溶液制備

2.1.1.1供試品溶液的制備 分別取本品6片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇15 ml，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.1．1.2對(duì)照藥材溶液的制備 連翹對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，加熱回流20 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.1．3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比(連翹除外) 根據(jù)制法制成的陰性樣品，取陰性樣品粉末1.8 g，加甲醇15 ml，照“2．1．1.1”項(xiàng)下方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。

2.1.2薄層條件與結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典)2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各6～8 μl ，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.2甘草的鑒別

2.2.1溶液制備

2.2.1.1供試品溶液的制備 分別取本品16片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇20 ml超聲30 min，濾過(guò)，濾液揮干，加水20 ml溶解，濾過(guò)，濾液加乙酸乙酯萃取2次,每次15 ml，揮干乙酸乙酯層，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。

2.2.1.2對(duì)照藥材溶液的制備 甘草對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比(甘草除外) 根據(jù)制法制成的陰性樣品，取陰性樣品粉末4.8 g，加甲醇20 ml，照“2．2．1.1”項(xiàng)下方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。

2.2.2薄層條件與結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各4～6 μl ，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶1∶0.5)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。再重新配置展開(kāi)劑進(jìn)行二次展開(kāi)，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

2.3人工牛黃的鑒別

2．3．1溶液制備

2.3.1.1供試品溶液的制備 分別取本品8片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇10 ml，超聲處理5 min，濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.3.1.2對(duì)照藥材溶液的制備 膽酸、豬去氧膽酸對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，濾液作為對(duì)照品溶液。

2.3.1.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比(人工牛黃除外) 根據(jù)制法制成的陰性樣品，取陰性樣品粉末2.4 g，加甲醇10 ml，照“2．3．1．1”項(xiàng)下方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。

2.3.2薄層條件與結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》)2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各4～6 μl ，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇(6∶32∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

3 含量測(cè)定

3.1色譜條件 參照《中國(guó)藥典》[1]2005年版一部有關(guān)測(cè)定方法，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm。Agilent zorbax 色譜柱C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；乙腈-水(52∶48)為流動(dòng)相；柱溫30 ℃；流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl。上述色譜條件下，理論板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000；分離度應(yīng)大于1.5。

3.2溶液的制備

3.2.1對(duì)照品溶液 取歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml含0.01 mg的溶液，即得。

3.2.2供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液25 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

A 對(duì)照藥材 A 對(duì)照藥材 A 對(duì)照藥材

B 供試品584004 B 陰性對(duì)照 B 陰性對(duì)照

C 供試品783001 C 供試品584004 C 供試品584004

D 供試品788002 D 供試品783001 D 供試品783001

E 供試品889002 E 供試品788002 E 供試品788002

F 陰性對(duì)照 F 供試品889002 F 供試品889002

圖1連翹TLC色譜圖圖2甘草TLC色譜圖圖3人工牛黃TLC色譜圖

3.2.3陰性樣品溶液的制備 按處方配比，取除白芷外的其他藥材，按牛黃化毒片的工藝方法，制得陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。精密吸取對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液各20 μl，注入液相色譜儀。在與歐前胡素對(duì)照品色譜峰相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處，無(wú)色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖4。

1．歐前胡素

3.3線性關(guān)系考察 取歐前胡素對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml含0.100 4 mg的溶液，作為儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液1、3、5、10和15 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液及儲(chǔ)備液20 μl，注入液相色譜儀，以濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=4.932 5×104X-4.967 4(r=0.999 9)。結(jié)果表明，歐前胡素在0.002 008～0.100 4 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品1份，按“3.2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，按“3.1 ”項(xiàng)下色譜條件分析，精密吸取供試品溶液20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中歐前胡素峰面積值，平均峰面積值為466.458 068，RSD為0.53%(n=6)。結(jié)果表明，精密度符合要求。

3.5重現(xiàn)性試驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品6份，按“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備法操作，按“3.1” 項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定歐前胡素的含量，結(jié)果測(cè)得樣品平均含量為0.072 3 mg/片，RSD為0.63 %，結(jié)果表明，重現(xiàn)性符合要求。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品1份，按“3.2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，按“3.1” 項(xiàng)下色譜條件分析，分別精密吸取供試品溶液20 μl，分別于0、2、5.5、9、16和24 h進(jìn)樣，測(cè)定歐前胡素的含量RSD為0.77%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

3.7回收率測(cè)定 取批號(hào)為889002的樣品6份，各0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入每1 ml含歐前胡素對(duì)照品0.004 823 mg的甲醇溶液25 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供回收率測(cè)定用的供試品溶液,按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.77%，RSD為0.67%。

3．8樣品測(cè)定 取其他牛黃化毒片樣品3批，按“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，按“3.1 ”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，計(jì)算3批樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定(n=2)

4 討論

4.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取歐前胡素對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，結(jié)果表明：歐前胡素對(duì)照品在249 nm與300 nm波長(zhǎng)處有較大吸收峰。參照《中國(guó)藥典》2005年版一部“白芷”項(xiàng)下含量測(cè)定，以300 nm波長(zhǎng)作為含量測(cè)定波長(zhǎng)。

4.2提取溶劑及提取方法的選擇 取批號(hào)為889002的樣品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，以甲醇、乙醚為溶劑，分別采用超聲處理、加熱回流及索氏提取3種方法進(jìn)行提取，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果表明采用甲醇作為溶劑，3種提取方法測(cè)定結(jié)果基本一致，明顯高于以乙醚為溶劑時(shí)3種提取方法測(cè)定結(jié)果。故選取甲醇作為溶劑，超聲處理的提取方法。

4.3提取時(shí)間的考察 取批號(hào)為889002的樣品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱(chēng)定重量，分別超聲處理30、60、90和120 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果顯示4個(gè)提取時(shí)間測(cè)定結(jié)果基本一致，為保證提取完全，故采用60 min作為提取時(shí)間。

4.4溶劑用量的考察 取批號(hào)為889002的樣品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果顯示2個(gè)提取溶劑用量含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，故選擇25 ml作為牛黃化毒片的提取溶劑用量。

4.5不同色譜柱含量測(cè)定的影響 取批號(hào)為788002樣品溶液，使用Agilent 1100高效液相色譜儀，分別使用Dikma C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱和phenomenex C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱，按照“3.1”色譜條件分析，測(cè)定樣品中歐前胡素的含量,結(jié)果三種色譜柱測(cè)得的含量分別為0.064 6、0.065 6和0.064 4 mg/片。三者含量平均值為0.064 9 mg/片，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯的影響。

4．6其他

中藥成分復(fù)雜，鑒別僅以單一成分為對(duì)照，難以反映藥品質(zhì)量，在盡可能的情況下，應(yīng)以有效成分和對(duì)照藥材為對(duì)照，并盡量簡(jiǎn)化操作過(guò)程。連翹中有效成分為連翹苷，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，按《中國(guó)藥典》2005年一部中連翹藥材的方法提取、分離，結(jié)果色譜斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重[2]，互相掩蓋，難以達(dá)到鑒別效果。而本實(shí)驗(yàn)可使供試品色譜的分離效果達(dá)到最佳，具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬性。

在甘草中有效成分為甘草酸銨，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)所含成分較為復(fù)雜，不易于分離，根據(jù)文獻(xiàn)[3]試過(guò)多種提取方法如正丁醇萃取、乙醚萃取等，但其效果不顯著，色譜斑點(diǎn)仍拖尾嚴(yán)重、互相掩蓋，不能達(dá)到鑒別分離的效果。而本實(shí)驗(yàn)可使供試品色譜的分離效果達(dá)到最佳，具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬性。

1 中國(guó)藥典.一部.2005：4，59，68，117，136

2 王春紅.補(bǔ)血膠囊的TLC定性鑒別.湖北中醫(yī)雜志，2002，24(4)：51

3 韓桂茹，徐韌柳，胡盂魁. 利肺片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2004，21(3)：209