HPLCELSD法測定硫酸西索米星的含量*

劉海玲，曹曉云

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

硫酸西索米星為氨基糖苷類廣譜抗生素，由于氨基糖苷類抗生素?zé)o特征紫外吸收，不能直接采用傳統(tǒng)HPLC-UV法測定，采用衍生化方法測定試驗(yàn)結(jié)果影響因素多。《中國藥典》2005年版二部采用抗生素微生物檢定法進(jìn)行含量測定[1],其操作煩瑣、專屬性差，并且影響因素多。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)為不含發(fā)色團(tuán)化合物的分析提供了一種新的檢測手段，其響應(yīng)值與被測物質(zhì)量成正比，不依賴于被測物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)[2]。近年來陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量分析[3-6]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法對硫酸西索米星進(jìn)行含量測定，方法靈敏度高、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好，可滿足質(zhì)量控制要求。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT高效液相色譜儀，Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器。西索米星標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號0353-200001)；硫酸西索米星為江蘇無錫山禾福祁制藥有限公司(批號20070801、20071001和20071002)和江蘇無錫第二制藥廠(批號20070503)提供。試驗(yàn)用水為娃哈哈飲用純凈水；三氟乙酸為TEDIA公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及適用性試驗(yàn)

2.1.1色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK TYPE：ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：0.3 mol/L三氟乙酸-甲醇-乙腈(96∶3∶1)；流速：0.5 ml/min；采用蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度：110 ℃，霧化氣體流速：3.0 L/min。

2.1.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別稱取慶大霉素C1a和西索米星對照品適量，用水溶解并稀釋制成每1 ml中含慶大霉素C1a0.1 mg和西索米星3 mg的溶液，作為分離度測試溶液①；稱取西索米星對照品約50 mg，加0.5 ml過氧化氫溶液(濃過氧化氫溶液10→100)溶解，水浴45 min后立即取出，放冷至室溫，加水稀釋至10 ml，搖勻，作為分離度測試溶液②。照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密量取分離度測試溶液①和②各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。西索米星峰與慶大霉素C1a峰的分離度為1.2；在相對保留時(shí)間0.80～0.95處應(yīng)能檢測出三個(gè)氧化降解物。色譜圖見圖1。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 取西索米星對照品適量，精密稱定，分別加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含西索米星0.12、0.15和0.18 mg的溶液，作為對照品溶液①、②和③。

2.2.2供試品溶液的制備 取供試品適量，精密稱定，用水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含西索米星0.15 mg的溶液，即得。照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別吸取對照品和供試品溶液各20 μl，色譜圖見圖2。

2.3線性關(guān)系考查 精密稱取西索米星對照品11.60、18.22、22.89、27.87和34.47 mg，分別置100 ml量瓶內(nèi)，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取各溶液20 μl注入液相色譜儀，按“2.1.1”色譜條件，記錄色譜圖。以對照品進(jìn)樣量對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積對數(shù)為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=1.602 7X+5.989 7(r=0.999 7)。結(jié)果表明西索米星進(jìn)樣量在1.271～3.778 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.4重現(xiàn)性試驗(yàn) 采用測定濃度的80%、100%和120%三個(gè)濃度，每個(gè)濃度分別制備三份供試品溶液，分別依法測定，結(jié)果RSD為1.01%(n=9)，表明重現(xiàn)性良好。

1.西索米星 2.慶大霉素C1a

1．西索米星

2.5樣品測定 采用本方法測定硫酸西索米星和采用抗生素微生物檢定法[1]測定的結(jié)果見表1，二者結(jié)果基本相符。

表1 兩種方法測定結(jié)果比較

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 氨基糖苷類抗生素極性較大，在ODS柱上不保留，可通過與揮發(fā)性酸形成離子對或采用堿性流動(dòng)相使氨基糖苷類抗生素游離成堿，降低極性以增加在色譜柱上的保留[4]。 采用堿性條件[5]，試驗(yàn)了乙酸胺系統(tǒng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，流動(dòng)相為堿性時(shí)，西索米星色譜峰峰形不對稱。 采用酸性條件，試驗(yàn)了五氟丙酸系統(tǒng)[6]，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著五氟丙酸濃度的增大，主峰出峰時(shí)間較晚，峰形不對稱。試驗(yàn)了三氟乙酸流動(dòng)相系統(tǒng)[4]，隨著流動(dòng)相中三氟乙酸濃度的增加，西索米星色譜峰的保留時(shí)間減少，峰形改善。因此選擇三氟乙酸作為流動(dòng)相的離子對試劑對西索米星進(jìn)行分析。

3.2蒸發(fā)光散射檢測器條件的選擇 考察漂移管溫度分別為80、100、105、110和115 ℃時(shí)的分析情況，試驗(yàn)結(jié)果表明，漂移管的溫度對檢測結(jié)果影響不顯著。分別考察載氣流速為2.0、2.5、3.0和3.5 L/min 時(shí)的分析情況，試驗(yàn)結(jié)果表明隨著載氣流速的減小，峰面積增大，基線則越不穩(wěn)定。綜合試驗(yàn)結(jié)果，確定漂移管溫度為110 ℃，載氣流速為3.0 L/min。

3.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的建立 試驗(yàn)中考查了一系列氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、硫酸鏈霉素、小諾霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星、依替米星、核糖霉素、新霉素、新霉胺和慶大霉素C1a等)在此色譜系統(tǒng)中的保留時(shí)間，慶大霉素C1a在西索米星主峰后被洗脫。

經(jīng)過不同破壞條件試驗(yàn)篩選，僅氧化破壞可出現(xiàn)主峰前緊鄰主峰的雜質(zhì)峰，擬定供試品以過氧化氫溶液(濃過氧化氫溶液10→100)水浴破壞45 min，可檢測到三個(gè)降解物的色譜峰。因此采用兩個(gè)分離度測試溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性控制。

3.4色譜柱粗放度試驗(yàn) 分別用CAPCELL PAK TYPE：ACR C18、Diamonsil C18和Agilent ZORBAX SB-C18三個(gè)品牌的(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，進(jìn)行硫酸西索米星含量測定，色譜峰峰形均良好，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)均符合要求，色譜柱粗放度好。

本方法采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，樣品不需要衍生化，可避免測定過程引入新的雜質(zhì)，提高了分析精度，用于硫酸西索米星含量測定，具有操作簡便、色譜系統(tǒng)穩(wěn)定、粗放度較好、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 中國藥典.二部.2005：748-749

2 陳冠華，潘淑萍，胡江寧.硫酸阿米卡星含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC-ELSD測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(3)：171

3 吳燕，張勝強(qiáng)，郭成明，等.HPLC-ELSD法分析硫酸奈替米星與硫酸西索米星的含量和有關(guān)物質(zhì).中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2004，5(4):35

4 王建, 王知堅(jiān), 陳貴斌,等.HPLC-ELSD和HPLC-MSn分析硫酸西索米星及其注射液.中國藥學(xué)雜志，2007，42(1): 62

5 Wang Mingjuan,Hu Changqin.Analysis of spectinomycin by HPLC with evaporative light-scattering detection.Chromatographia,2006,63(5/6):255

6 Megoulas N C,Koupparis M A.Development and validation of novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals,plasma,and urine.Anal Bioanal Chem,2005,382(2):290