一株新城疫病毒的分離鑒定

文│鄒立宏 [瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司]

翟含流（河北省保定市北市區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督）

新城疫（Newcastle disease， ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種侵害禽類的急性、高度接觸性傳染病。2011年6月，某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)了疑似新城疫的病情，雞群34日齡發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振，采食量下降50%、并伴有嚴(yán)重的呼吸道癥狀，拉綠色糞便。發(fā)病率20%左右，死亡率14%左右。剖檢發(fā)現(xiàn)氣管環(huán)出血、肌胃底部、腺胃潮紅，十二指腸、卵黃蒂附近有棗核狀潰瘍和出血，盲腸扁桃體出血，直腸條狀出血，腎臟腫脹。為了對(duì)該病作出準(zhǔn)確診斷并制定出有效的防控措施，采集病雞氣管、腎臟、腦等組織，進(jìn)行病原的分離與鑒定。

一、材料與方法

1.材料。

（1）SPF雞胚及SPF雞。9～11日齡SPF雞胚和SPF雞均購(gòu)自北京梅里亞-維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

（2）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、禽流感（A1）H9、H5標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

2.方法。

（1）病毒分離。無(wú)菌采集病死雞氣管、腎臟、腦，放入研缽中剪成小塊，加入滅菌的PBS沖洗，洗去紅細(xì)胞，反復(fù)2～3次。然后將病料加入研磨器中磨碎，加少量滅菌PBS液稀釋，反復(fù)凍融3次后，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清，用0.22微米的濾膜濾過(guò)除菌，將濾液接種10日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)，無(wú)菌收集尿囊液（棄去24小時(shí)死亡雞胚），-20℃保存。

（2）血凝性檢測(cè)。收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)。

（3）血凝抑制試驗(yàn)。按常規(guī)將具有血凝性的病毒，分別與新城疫、禽流感（H9或H5）陽(yáng)性血清進(jìn)行交叉HI試驗(yàn)。

（4）病毒毒力的測(cè)定。按常規(guī)方法，分別測(cè)定雞胚半數(shù)致死量（ELD50）、最小致死量致死雞胚的平均時(shí)間（MDT）、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）。

（5）動(dòng)物回歸試驗(yàn)。取10只35日齡的SPF雞，將分離毒經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑攻毒，每只雞攻10-5ELD50/0.1毫升，觀察雞群變化。

二、結(jié)果

1.病毒分離鑒定。SPF雞胚在接種分離病毒后48小時(shí)內(nèi)死亡，死亡雞胚全身嚴(yán)重出血、水腫，肝臟有壞死和出血點(diǎn)。雞胚尿囊液的血凝價(jià)為28，和抗NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、抗AIV H9亞型與H5亞型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 SD1106株尿囊液和參考血清的HI試驗(yàn)結(jié)果

2.病毒毒力的測(cè)定。新城疫分離株的ELD50為10-7.74；MDT為51.7小時(shí)（強(qiáng)毒40～60小時(shí)）；ICPI為1.91（1.6～2.5），由此可見(jiàn)，該新城疫分離株為強(qiáng)毒。

3.動(dòng)物回歸試驗(yàn)。10只SPF雞，在攻毒后48小時(shí)左右雞只出現(xiàn)精神沉郁，表現(xiàn)為閉眼、嗜睡、不愿行動(dòng)，采食下降，并出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀， 144小時(shí)內(nèi)全部死亡，剖檢出現(xiàn)典型的新城疫癥狀：腺胃乳頭點(diǎn)狀出血、十二指腸出血、卵黃蒂、回腸處的淋巴濾泡出血、盲腸扁桃體出血、氣管內(nèi)有黏液、氣管環(huán)出血。

三、討論

本研究通過(guò)HA-HI試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，證明分離到的毒株為新城疫病毒，通過(guò)毒力測(cè)定，MDT為51.7小時(shí)，ICPI為1.91。根據(jù)目前NDV毒力判定標(biāo)準(zhǔn)MDT40～60小時(shí)為強(qiáng)毒，ICPI1.6～2.5為強(qiáng)毒。分離到的毒株為新城疫強(qiáng)毒株。

新城疫的發(fā)生與流行與日常的飼養(yǎng)管理、疫苗的種類、免疫程序等有很大關(guān)系，同時(shí)，新城疫病毒發(fā)生部分抗原變異也可能是一個(gè)重要因素。曹殿軍等對(duì)我國(guó)分離株進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，我國(guó)流行的NDV既有基因I、II、III、IV、V、VI，又有新的基因VII、VIII型的流行，而我國(guó)目前使用的疫苗大多屬于基因I、II，與一些流行毒株基因型有較大不同，所以用常規(guī)疫苗進(jìn)行雞群的免疫不能獲得有效的保護(hù)。