子宮內(nèi)膜異位癥患者雌*、孕激素受體和Bcl-2、Bax表達(dá)的研究

李 斌 王 君 范 穎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100029)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)多發(fā)生于育齡婦女,是一種雌激素依賴性疾病。正常子宮內(nèi)膜的增殖和分泌受到雌孕激素及其受體(ER、PR)的調(diào)節(jié)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為 EM患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡減弱、增殖增強(qiáng)[1,2]。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法檢測 EM在位及異位內(nèi)膜上 ER、PR與凋亡抑制基因(Bcl-2)、促凋亡基因(Bax)的表達(dá)情況,探討雌孕激素受體在 EM細(xì)胞凋亡與增殖活動中的調(diào)控作用。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

EM組 40例,年齡 26～45歲,(36.0±6.3)歲。選取 2006年 8月 ～2007年 8月在我院因 EM行腹腔鏡手術(shù)的患者,術(shù)中取在位及異位子宮內(nèi)膜,術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為 EM,其中增殖期 20例,分泌期 20例。

對照組 40例,年齡 27～44歲,(34.6±5.2)歲。為同期因其他非激素依賴性疾病(15例輸卵管積水、13例卵巢漿液性囊腺瘤、12例卵巢黏液性囊腺瘤)行腹腔鏡手術(shù)患者的子宮內(nèi)膜,增殖期 20例,分泌期 20例。符合以下標(biāo)準(zhǔn):①月經(jīng)周期規(guī)則,經(jīng)量中等;②術(shù)中及術(shù)后病理證實(shí)無子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、子宮肌瘤、宮內(nèi)節(jié)育器、不明原因的不孕癥及能分泌激素的卵巢腫瘤等可能影響觀察指標(biāo)的疾病;③診刮排除子宮內(nèi)膜病變;④至少 6個月內(nèi)未服用甾體類激素(包括避孕及流產(chǎn)藥物)。2組年齡統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異(t=1.084,P=0.282)。

1.2 方法

標(biāo)本離體后經(jīng) 10%福爾馬林固定,石蠟包埋,每份標(biāo)本連續(xù)切片 4μm×5張,一張進(jìn)行 HE染色作月經(jīng)周期分期,其余做免疫組化鏈霉素抗生物蛋白 -過氧化物酶(SP)法染色,檢測 EM患者和對照組子宮內(nèi)膜組織中 ER、PR、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。一抗工作液均為 1:50濃度。陰性對照以磷酸緩沖液(PBS)代替一抗。陽性對照采用乳腺癌組織切片。以上試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

SP染色具體步驟:石蠟切片脫臘和水化后,用PBS(pH 7.4)沖洗 3次,每次 3min。根據(jù)每一種抗體的要求對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。每張切片加1滴 3%過氧化氫溶液,室溫下孵育 15 m in,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗 3次,每次 3 min。除去 PBS液,每張切片加 1滴正常山羊血清封閉抗原,室溫下 15min。除去血清,每張切片加 1滴一抗,4℃過夜。PBS沖洗 3次,每次 3 min。除去 PBS液,每張切片加 1滴二抗,37℃孵育 15min。PBS沖洗 3次,每次 3 min。除去 PBS液,每張切片加 1滴鏈霉菌抗生物素 -過氧化物酶溶液,37℃孵育 15m in。 PBS沖洗 3次,每次 3 min。除去 PBS液,每張切片滴加 DAB顯色劑,顯微鏡下觀察 3～10min。自來水沖洗,蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3 結(jié)果判定

采用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量測定內(nèi)膜細(xì)胞ER、PR、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況,免疫組化切片經(jīng) 2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察,每名觀察者選擇染色均勻的區(qū)域,以切片中細(xì)胞著棕黃、棕褐色為陽性細(xì)胞(圖 1～12),每張切片在高倍(×400)光鏡下隨機(jī)選取 5個視野,測出每個視野陽性細(xì)胞的平均光密度(OD)值,光密度值與 ER、PR、Bcl-2、Bax表達(dá)量成正比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,采用 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有顯著性。相關(guān)性分析采用直線相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 增殖期 ER、PR、Bcl-2和 Bax表達(dá)情況(光密度值)的比較(表1)

增殖期 ER表達(dá):EM患者在位內(nèi)膜高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),異位內(nèi)膜高于正常內(nèi)膜(P＜0.05);增殖期 PR表達(dá):EM患者在位內(nèi)膜高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),異位內(nèi)膜低于正常內(nèi)膜(P＜0.05);增殖期 Bcl-2表達(dá):EM患者在位內(nèi)膜高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),異位內(nèi)膜高于正常內(nèi)膜(P＜0.05);增殖期 Bax表達(dá):EM患者異位內(nèi)膜低于正常內(nèi)膜(P＜0.05)。增殖期 Bax表達(dá),在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 增殖期 ER、PR、Bcl-2、Bax表達(dá)情況的比較(OD值)±s)

表1 增殖期 ER、PR、Bcl-2、Bax表達(dá)情況的比較(OD值)±s)

組別 ER PR Bcl-2 Bax正常子宮內(nèi)膜(n=20)① 0.332±0.012 0.258±0.011 0.271±0.019 0.276±0.024 EM異位內(nèi)膜(n=20)② 0.408±0.009 0.229±0.009 0.339±0.017 0.261±0.018 EM在位內(nèi)膜(n=20)③ 0.519±0.021 0.261±0.017 0.401±0.023 0.254±0.016 F,P值 796.99,0.000 38.17,0.000 215.17,0.000 6.56,0.003 q,P值 q3-1=56.128,P＜0.05 q3-2=33.317,P＜0.05 q2-1=22.811,P＜0.05 q3-1=1.049,P＞0.05 q3-2=11.186,P＜0.05 q2-1=10.138,P＜0.05 q3-1=29.327,P＜0.05 q3-2=13.987,P＜0.05 q2-1=15.340,P＜0.05 q3-1=5.012,P＜0.05 q3-2=1.595,P＞0.05 q2-1=3.417,P＜0.05

2.2 分泌期 ER、PR、Bcl-2和 Bax表達(dá)情況(光密度值)的比較(表2)

分泌期 ER表達(dá):EM患者在位內(nèi)膜高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),異位內(nèi)膜高于正常內(nèi)膜(P＜0.05);分泌期 PR表達(dá):EM患者在位內(nèi)膜高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),正常內(nèi)膜與異位內(nèi)膜 PR表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);分泌期 Bcl-2表達(dá):EM患者在位內(nèi)膜高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),異位內(nèi)膜高于正常內(nèi)膜(P＜0.05);分泌期 Bax表達(dá):EM患者異位內(nèi)膜低于正常內(nèi)膜(P＜0.05),在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 分泌期 ER、PR、Bcl-2、Bax表達(dá)情況的比較(OD值)±s)

表2 分泌期 ER、PR、Bcl-2、Bax表達(dá)情況的比較(OD值)±s)

組別 ER PR Bcl-2 Bax正常子宮內(nèi)膜(n=20)① 0.303±0.015 0.228±0.013 0.246±0.021 0.303±0.019 EM異位內(nèi)膜(n=20)② 0.365±0.011 0.220±0.014 0.325±0.018 0.267±0.020 EM在位內(nèi)膜(n=20)③ 0.466±0.018 0.278±0.016 0.406±0.014 0.259±0.025 F,P值 606.18,0.000 95.46,0.000 399.60,0.000 23.78,0.000 q,P值 q3-1=48.778,P＜0.05 q3-2=30.225,P＜0.05 q2-1=18.554,P＜0.05 q3-1=15.542,P＜0.05 q3-2=18.028,P＜0.05 q1-2=2.487,P＞0.05 q3-1=39.979,P＜0.05 q3-2=20.239,P＜0.05 q1-2=19.740,P＜0.05 q3-1=9.155,P＜0.05 q1-2=7.490,P＜0.05 q3-2=1.665,P＞0.05

2.3 相關(guān)性分析

EM患者異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜 ER與 PR表達(dá)無相關(guān)性,EM患者異位內(nèi)膜 ER與 Bax、PR與 Bax表達(dá)無相關(guān)性。雖然 ER、PR與 Bcl-2在 EM患者在位內(nèi)膜表達(dá)均增強(qiáng),但 EM患者異位內(nèi)膜 ER與 Bcl-2、PR與 Bcl-2表達(dá)無相關(guān)性,EM患者在位內(nèi)膜 ER與 Bax、PR與 Bax表達(dá)無相關(guān)性 (r=-0.031、0.281,P=0.891、0.729)。見表3,4。

表3 EM患者異位內(nèi)膜細(xì)胞 ER、PR、Bcl-2、Bax相關(guān)性

表4 EM患者在位內(nèi)膜細(xì)胞 ER、PR、Bcl-2、Bax相關(guān)性

3 討論

EM在生育年齡婦女發(fā)病率為 10%～15%[3],在婦科疾病中,其發(fā)病率僅次于子宮肌瘤[4]。EM是激素依賴性疾病,雖為良性病變,卻具有類似惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和種植生長的能力。自 1860年 Von Rokitansky在 1具尸體檢查中首次發(fā)現(xiàn)該病以來已經(jīng)有 140余年的歷史,但由于人們對其發(fā)病機(jī)制尚未清楚,治療結(jié)果一直不理想。探討內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制一直是婦科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

甾體類激素通過核內(nèi)受體蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用,其生物學(xué)效應(yīng)受配基和受體水平影響。當(dāng)受體與激素結(jié)合形成復(fù)合物后,以活化的形式結(jié)合到染色質(zhì)特定部位,繼發(fā)新的蛋白質(zhì)形成,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、代謝。正常子宮內(nèi)膜組織中 ER與 PR存在一定的正相關(guān)關(guān)系,PR隨 ER的上升而增加,PR的合成依賴于 ER的合成通路[5]。本研究提示 EM患者無論是增殖期還是分泌期,在位內(nèi)膜 ER、PR表達(dá)均高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),并且 ER在異位內(nèi)膜的表達(dá)高于正常內(nèi)膜(P＜0.05),這種改變既減輕了體內(nèi)性激素周期性波動對在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長的影響,又提高了在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在分泌期對 E2的敏感性,使在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞持續(xù)低水平增殖。提示 EM的發(fā)生可能與 ER在在位內(nèi)膜的高表達(dá)有關(guān),支持“在位內(nèi)膜決定論”[6],同時也印證了 EM是一種雌激素依賴性疾病。

Bcl-2被稱為“凋亡抑制基因”。Bcl-2過度表達(dá)可通過抑制程序性細(xì)胞死亡來阻礙或延遲正常細(xì)胞的分化,從而延長細(xì)胞的壽命。Bax是促凋亡基因,可以自身形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡。正常子宮內(nèi)膜Bcl-2與 Bax表達(dá)具有一定周期性,Bcl-2表達(dá)增殖期高于分泌期、Bax表達(dá)分泌期高于增殖期[7～9],說明雌孕激素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與增殖來維持子宮內(nèi)膜的正常生理功能。本研究提示 EM患者無論是在位內(nèi)膜還是異位內(nèi)膜均表現(xiàn)為 Bcl-2表達(dá)較正常內(nèi)膜增強(qiáng)(P＜0.05),而 Bax表達(dá)減弱,Bcl-2/Bax比值上升。Bcl-2和 Bax的表達(dá)均與子宮內(nèi)膜周期性改變無關(guān),不受卵巢激素調(diào)節(jié),細(xì)胞凋亡持續(xù)性減弱,增殖性能持續(xù)性增強(qiáng)。無論是增殖期還是分泌期 EM患者在位內(nèi)膜 Bcl-2表達(dá)均高于異位內(nèi)膜(P＜0.05),說明在位內(nèi)膜比異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡更弱、增殖性能更強(qiáng),可能這樣的內(nèi)膜異位于盆腹腔或腹壁切口,導(dǎo)致了 EM的發(fā)生,支持“在位內(nèi)膜決定論”。同時也提示提示內(nèi)膜細(xì)胞抗凋亡能力明顯增強(qiáng),破壞了細(xì)胞增殖和凋亡的平衡,使異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率下降,細(xì)胞周期延長;異位灶得以不斷發(fā)展,與 Ding等[10]的結(jié)論相似。可見子宮內(nèi)膜異位灶 Bcl-2和 Bax表達(dá)異?？赡軈⑴c了 EM子宮內(nèi)膜凋亡特性的改變,并對 EM的發(fā)生和發(fā)展起到一定的作用。

Lessby等[11]研究正常子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞 Bcl-2和雌、孕激素受體的周期性表達(dá),結(jié)果顯示三者表達(dá)一致,三者具有正相關(guān)關(guān)系。EM患者內(nèi)膜細(xì)胞中 ER、PR、Bcl-2、Bax表達(dá)是否具有相關(guān)性,本課題希望以此為切入點(diǎn),探討雌孕激素受體在 EM患者內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與增殖活動的調(diào)控作用,將 EM的發(fā)病機(jī)制深入到調(diào)控基因水平。本研究結(jié)果提示,EM患者在位及異位內(nèi)膜 ER、PR表達(dá)不同步;雖然 ER、PR與Bcl-2在 EM患者在位內(nèi)膜表達(dá)均增強(qiáng),但兩者不具有相關(guān)性(兩兩相關(guān) P值均 ＞0.05)。通過本研究還不能說明雌孕激素受體在 EM細(xì)胞凋亡與增殖活動中具有調(diào)控作用。也有研究認(rèn)為 ERβ與 Bcl-2的基因表達(dá)呈相關(guān)性,提示雌激素通過 β受體亞型途徑介導(dǎo) Bcl-2的表達(dá)[12]。本研究結(jié)果未顯示 ER、PR與Bcl-2、Bax之間有相關(guān)關(guān)系,可能與本研究檢測的是傳統(tǒng)的 ERα和 PR-A亞型有關(guān)。

圖 1 內(nèi)異癥在位內(nèi)膜ER陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400) 圖 2 內(nèi)異癥異位內(nèi)膜 ER陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400) 圖 3 正常子宮內(nèi)膜 ER陽性表達(dá)(免疫組化SP染色 ×400) 圖4 內(nèi)異癥在位內(nèi)膜PR陽性表達(dá)(免疫組化SP染色 ×400) 圖 5 內(nèi)異癥異位內(nèi)膜 PR陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400) 圖 6正常子宮內(nèi)膜 PR陽性表達(dá)(免疫組化SP染色 ×400) 圖 7 內(nèi)異癥在位內(nèi)膜Bc l-2陽性表達(dá)(免疫組化SP染色 ×400) 圖 8 內(nèi)異癥異位內(nèi)膜 Bcl-2陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400) 圖 9 正常子宮內(nèi)膜 Bc l-2陽性表達(dá)(免疫組化SP染色 ×400) 圖 10 內(nèi)異癥在位內(nèi)膜 Bax陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400) 圖 11內(nèi)異癥異位內(nèi)膜 Bax陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400) 圖 12 正常子宮內(nèi)膜 Bax陽性表達(dá)(免疫組化 SP染色 ×400)

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