氯化兩面針堿對肝癌細胞增殖的抑制作用及機制探討

歐賢紅，廖柳鳳，劉華鋼，李丹妮

(廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧530021)

氯化兩面針堿(NC)是由蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根中提取的一種生物堿［1，2］。研究表明NC具有抗腫瘤活性，可抑制 B16、MCF-7、HS578T、DU145、MPC3 等癌細胞增殖［3］。2009 ～2010 年，我們觀察了NC對肝癌SMMC-7721細胞(以下簡稱肝癌細胞)DNA聚合酶δ催化亞基P125的影響，探討抑制肝癌細胞增殖的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SMMC-7721細胞系購于中國科學院上海細胞庫，由本實驗室傳代培養(yǎng)。NC購于中國藥品生物制品檢定所，批號 110848-20001，純度大于98%。1640培養(yǎng)液購于Thermo Scientific公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料技術有限公司。胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Amersco公司。羊抗 P125多克隆抗體(Santa Cruz)。HRP標記鼠抗GAPDH單克隆抗體(上?？党?。HRP標記抗羊IgG(北京中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將肝癌細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，待細胞長至約80%密度時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞集落形成能力測定 取對數(shù)生長期細胞，稀釋至終濃度為0.25/L單個分散的細胞懸液。按每孔4 ml細胞懸液接種于6孔板，每組平行3孔。24 h后加藥，設陰性對照組及給藥組，給藥組予 NC 干預，質量濃度分別為 0.15、0.30、0.60 mg/L。37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，Giemsa(Giemsa粉 0.5 g，甘油 22 ml，甲醇33 ml，用時以1∶9 與Sorensen緩沖液混合)染色，計數(shù)每孔含50個細胞以上的克隆原細胞集落。計算集落形成抑制百分率。

1.2.3 細胞 P125表達檢測 采用 Western blot法［4］。細胞分組及干預同 1.2.2，常規(guī)消化并收集細胞，離心后棄上清，用預冷PBS洗2次，按說明書加入RIPA(用前按1∶100加入PMSF)，混勻細胞，置于冰上30min。4℃，1×104r/min離心10min，吸取上清即為蛋白，取少許進行蛋白定量，剩余蛋白質－80℃貯存。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。80 μg蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE膠分離后轉移到PVDF膜(Millipore)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜，TBST洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)ECL檢測系統(tǒng)檢測。結果用Quantity One 462軟件分析。GAPDH為內參照，以P125灰度值/內參照灰度反映P125蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用t檢驗進行組間比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞系集落形成能力 見表1。

表1 NC對各組細胞系集落形成能力的抑制率

2.2 P125表達 對照組P125水平為0.56±0.11;給藥組 0.6、0.3、0.15 mg/L NC 作用后分別為 0.15±0.08、0.19 ± 0.12、0.37 ± 0.12;與對照組比較，0.6、0.3、0.15 mg/L NC 作用后 P125 表達顯著性降低(P ＜0.05)。

3 討論

癌細胞的惡性增殖與DNA的大量復制相關，DNA聚合酶δ是真核生物DNA復制的最主要復制酶，可與增殖細胞核抗原(PCNA)和復制因子C(RFC)結合后完成前導鏈和隨從鏈的合成［5］。DNA聚合酶δ的聚合酶和外切酶二者活性位于其催化亞基P125。只有通過其上的PIP-box和KA-box兩個PCNA相互作用位點，P125與PCNA相互作用才能發(fā)揮其功能活性［6，7］。

NC是從廣西特有藥用植物兩面針根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿。有研究表明，NC對包括肝癌等多種腫瘤均有抑制作用［8］，其可能通過抑制DNA聚合酶而破壞DNA合成［9］。本研究采用集落形成實驗證實NC可明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721增殖。該結果與我們前期采用MTT法檢測結果一致［10，11］。采用 Western blot檢測 P125 蛋白的表達時發(fā)現(xiàn)NC可明顯下調P125的表達。從而推測NC有可能通過下調P125蛋白的表達抑制肝癌細胞的惡性增殖。氯化兩面針堿的抗癌機制可能是多方面的，既有抑制拓樸異構酶Ⅰ、Ⅱ，阻止DNA復制，產(chǎn)生細胞毒作用;也有對DNA堿基對的嵌入作用，從而阻止DNA合成;還有分子中正電荷與生物大分子上負電荷的靜電作用以及可能的化學反應。究竟何種途徑更為重要，有待深入研究。

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