奧硝唑緩釋膜用于鼠類動物的生物安全性評價

徐全臣，陳秀娟，王志國，劉夢東，耿新杰

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

羧甲基殼聚糖(CM-C)是殼聚糖的水溶性衍生物，其可溶可吸收的特性作為成膜載體已經(jīng)越來越受到人們的重視。研究顯示，以CM-C為載體，奧硝唑為主藥制成的緩釋藥膜，質(zhì)量控制可靠，抑菌性和緩釋性能良好［1，2］。為了保證該藥膜用于人體時安全，2009年12月～2010年10月，我們按照國家規(guī)定，對藥膜進行了生物安全性評價。

1 材料與方法

1．1 材料 實驗動物為6周齡左右健康昆明小鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量17～23 g，由青島市藥品檢驗所提供。白色豚鼠40只，體質(zhì)量300～350 g，雌雄各半，由青島市藥檢所實驗動物中心提供。SPF級Wistar大鼠10只，雌雄各半，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗細胞為V79細胞(中國倉鼠肺成纖維細胞)，由中國科學(xué)院上海生物科學(xué)院細胞資源中心提供。

1．2 方法

1．2．1 藥膜的制備 取 CM-C 1．6 g，溶于40 ml純化水中，配成4%的溶液;取高聚合物聚乙烯醇(PVA)1．6 g，溶于40 ml純化水中，配成4%的PVA溶液。將兩種溶液混合，加入甘油1 ml后攪拌4 h，加入0．48 g奧硝唑，繼續(xù)攪拌4 h，然后把共混液倒入一底面光滑的圓形金屬槽中。放入烘箱50℃烘干，12 h后取出即得藥膜。所制藥膜厚0．3 mm，可分切出任意大小形狀。乙醇消毒后裝入密封袋中保存。掃描電鏡觀察見藥膜呈蜂窩狀，孔隙均勻，直徑約 3 μm 。

1．2．2 急性毒性實驗 昆明小鼠10只，隨機分為實驗組和對照組，每組5只;實驗組于尾靜脈恒速注射載體浸提液50 ml/kg、對照組注射同批號滅菌生理鹽水50 ml/kg，于注射后 4、24、48、72 h 觀察動物有無輕、中、重度毒性反應(yīng)或死亡情況。

1．2．3 細胞毒性實驗 實驗分3組:藥膜浸提液組、陰性對照組(RPMI 1640培養(yǎng)液)、陽性對照組(0．1%苯酚)。將對數(shù)生長期的V79細胞用0．25%胰酶消化，制成1×104/ml的細胞懸液，取出96孔細胞培養(yǎng)板，分別加入細胞懸液100 μl，置37℃培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁，棄去原培養(yǎng)液，分別加入各組材料(100 μl/孔)，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng) 2、4、7 d 后，每孔加入 MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入緩沖鹽溶液150 μl，清洗2次，棄除余液，立即加入二甲基亞砜150 μl/孔，室溫放置并輕度振蕩15～20 min。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度值(OD)，各組細胞按下式計算細胞相對增殖度(RGR)。RGr=實驗組OD/陰性對照組OD×100%。

1．2．4 皮膚過敏實驗［3］40只健康白色豚鼠隨機平均分為4組:奧硝唑藥膜組、基質(zhì)組、陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(2，4-二硝基氯苯)。實驗前24 h仔細將豚鼠背部兩側(cè)剪毛，面積約3 cm×3cm。分別用0．2 ml 125 g/L奧硝唑藥膜浸提液、等體積基質(zhì)浸提液、生理鹽水、1%2，4-二硝基氯苯涂于豚鼠左側(cè)脫毛區(qū)，用1層油紙及2層消毒紗布覆蓋，以膠布固定，持續(xù)6 h;7 d和14 d以同樣方法重復(fù)1次，共3次。于末次給藥致敏后14 d，將受試物0．2 ml涂于豚鼠右側(cè)脫毛區(qū)，其中陽性對照用0．1%2，4-二硝基氯苯，6 h后去掉受試物，溫水沖洗干凈，即刻觀察并記錄6、24、48 h皮膚及心率、呼吸等情況。根據(jù)出現(xiàn)的紅斑與水腫情況評分計算反應(yīng)值，最后計算出實驗動物皮膚致敏率結(jié)果。

1．2．5 體內(nèi)降解實驗 10只Wistar大鼠，背部剪毛形成約4 cm×4 cm的術(shù)野，沿脊柱作一長約2 cm的切口，取脊柱兩側(cè)等距離的兩個肌肉位點，用止血鉗分離脊柱兩側(cè)肌肉，形成足夠間隙。奧硝唑藥膜剪成4．0 mm×8．0 mm長方形，烘致恒重，經(jīng)紫外線消毒，植入大鼠背部肌肉。1、2、4、6周切取標(biāo)本，洗去黏附物，烘致恒重，按下式計算降解百分率。降解百分率=(W0-W1)/W0×100%;W0為降解前質(zhì)量(g)，W1為降解后質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果

2．1 急性毒性實驗 實驗組和對照組小鼠狀況良好，未見明顯毒性癥狀，72 h內(nèi)活動如常，飲食飲水均正常，無動物死亡現(xiàn)象，動物體質(zhì)量日益增加。

2．2 細胞毒性實驗 藥膜浸提夜組毒性分級為0～Ⅰ級，說明藥膜對細胞無不良反應(yīng)，符合國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 各組在不同培養(yǎng)時間的OD值、RGR及細胞毒性分級

2．3 皮膚過敏實驗 實驗組觀察6、24、48 h，皮膚過敏實驗致敏率均為0，陽性對照組分別為90%、100%、100%。

2．4 體內(nèi)降解實驗 1周時實驗組內(nèi)置膜取出后基本完整，表面粗糙，有白色及紅色絮狀附著物。第2周時，內(nèi)置膜已成凝膠狀，較第1周明顯變薄，與周圍組織易區(qū)分。第4～6周呈菲薄致密近透明的銀白色纖維囊，周圍組織顏色正常。1、2、4、6周奧硝唑藥膜降解百分率分別為15%、35%、72%、98%。

3 討論

生物材料在應(yīng)用于人體之前必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗，除臨床應(yīng)用所要求的機械及理化性外，還應(yīng)具有良好的生物安全性。CM-C是殼聚糖的水溶性衍生物，具有良好的生物相容性以及可降解性［4］。本實驗中，奧硝唑緩釋藥膜無全身急性毒性及皮膚過敏性，埋植于大鼠肌肉后2周時已經(jīng)融化，6周時幾乎完全降解，齦溝中的液體量多于肌肉組織，推測藥膜在3周左右即可完全降解。

以CM-C為載體的緩釋藥膜質(zhì)地均勻，在電鏡下觀察，材料表面呈蜂窩狀，縱剖面上有較規(guī)則的通道，這些孔和通道相互構(gòu)成網(wǎng)架，形成三維立體結(jié)構(gòu)，適合細胞的三維生長，能為新生組織提供良好的支架。在細胞毒性實驗中，實驗組細胞在第4天和第7天的細胞相對增殖率大于100%，表現(xiàn)出對細胞生長的促進作用，這種促進作用與文獻報道的CM-C能夠促進成纖維細胞的生長的結(jié)論相一致［5］?；谝陨蟽牲c我們推測，將緩釋藥膜置于牙周袋內(nèi)，能夠促進牙周膜成纖維細胞的再生。

綜上所述，以CM-C為載體，奧硝唑為主藥制成的緩釋藥膜具有良好的生物安全性，可望應(yīng)用于臨床。

［1］徐全臣，鐘德鈺，吉秋霞，等．奧硝唑緩釋膜體內(nèi)外釋放度的研究［J］．中國藥房，2007，18(1):33．

［2］徐全臣，王志國，鄧婧，等．奧硝唑緩釋膜生物學(xué)性能的初步研究［J］．中國海洋藥物，2009，28(6):36．

［3］孫敬方．動物實驗方法學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:195-375．

［4］Wang LC，Chen XG，Xu QC，et al．Plasma protein adsorption pattern and tissue-implant reaction of poly(vinyl alcohol)/carboxymethyl-chitosan blend films［J］．J Biomater Sci Polym Ed，2008，19(1):113．

［5］王征，劉萬順，韓寶芹，等．不同分子量羧甲基殼聚糖的制備及其對皮膚成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞生長的影響［J］．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2007，24(2):340．