基于ITS2條形碼的中藥材威靈仙與其易混偽品的鑒定

曾旭 李莉 業(yè)寧 姚輝 劉志華 秦民堅(jiān)

2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定威靈仙為毛茛科植物威靈仙ClematischinensisOsbeck，棉團(tuán)鐵線蓮ClematishexapetalaPall.或東北鐵線蓮ClematismanshuricaRupr.的干燥根及根莖[1]。威靈仙具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)止痹痛等功效，凡風(fēng)濕痹痛，麻木不仁，無論上下，皆可應(yīng)用，是治療風(fēng)濕痹痛的要藥。作為中國(guó)常用中藥由于用藥歷史悠久，分布范圍廣泛，地區(qū)用藥習(xí)慣差異較大，威靈仙藥材使用混亂現(xiàn)象十分嚴(yán)重。北方常見百合科菝葜屬Smilax植物作威靈仙入藥，而南方常見以毛茛科鐵線蓮屬Clematis植物作威靈仙入藥[2,3]。云南部分地區(qū)菊科植物顯脈旋復(fù)花InulaneruosaWall.的根莖及根作威靈仙入藥。四川地區(qū)，金粟蘭科植物草珊瑚Sarandraglabra(Thunb.)NaRai的干燥根莖及全草作銅腳威靈仙入藥[4]。由于缺乏專業(yè)的鑒定人員加之市場(chǎng)需求量大致使威靈仙藥材常借不應(yīng)求，廣東地區(qū)曾發(fā)生過威靈仙與桃耳七混用的情況，造成數(shù)十人中毒的嚴(yán)重后果[5]。也曾出現(xiàn)過將毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥須根加工染色來冒充威靈仙使用[6]。由此我們急需一種迅速、簡(jiǎn)便有效的方法來鑒別威靈仙藥材與其混偽品，為保證藥材的真實(shí)性和指導(dǎo)臨床用藥安全提供科學(xué)依據(jù)，有必要對(duì)威靈仙正品來源與其各地混用品種進(jìn)行鑒別研究。

DNA條形碼(DNA barcoding)是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)和方向，該技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。通過種間具有足夠的變異、種內(nèi)特異性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定[7,8]。自2003年由加拿大分類學(xué)家PaulHebert首次選取以線粒體細(xì)肥色素C氧化酶亞基(COI)對(duì)動(dòng)物物種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無論在哪個(gè)分類水平上該基因都具有良好的識(shí)別能力，該技術(shù)得到了各國(guó)專家的廣泛關(guān)注[9,10]。對(duì)于植物來說，通用的DNA條形碼序列仍未最終確定世界各地者都稱極投入到植物通用條形碼的研究當(dāng)中，得到了初敊的可喜成果。陳士林課題組選取真核生物rDNA位于5.8S和26S rRNA之間的一段順反子ITS2序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ITS2序列不僅可以用于植物的DNA條形碼研究，而且對(duì)于動(dòng)物的DNA條形碼研究也具有重要的意義，在中藥材的物種鑒定方面具有潛在的研究?jī)r(jià)值[11-18]。本研究即是利用ITS2序列對(duì)威靈仙基源植物及其多種混偽品進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，為該藥材的準(zhǔn)確鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源見表1，包括實(shí)驗(yàn)樣品及來自Genbank下載序列，實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖副研究員進(jìn)行鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。

表1 材料來源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

商品藥材根使用70%乙醇擦洗表面后研磨，取樣約15 mg；植物葉片采用硅膠進(jìn)行干燥，取樣約30 mg，利用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

擴(kuò)增引物正向?yàn)?′-GCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向?yàn)?′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR體系含MgCl22 μl (25 mm)、dNTP 2 μl (2.5 mm)、PCR buffer 2.5 μl(10×)、引物各1.0 μl (2.5 μm)(Sangon Co., China)、聚合酶1.0 U (Biocolor BioScience & Technology Co., China)、總DNA 約1 μl，共為25 μl的反應(yīng)體積。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5分鐘；94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72℃ 45秒，40轉(zhuǎn)；72℃ 10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Tiangen Biotech Co., China)回收，純化后作為測(cè)序反應(yīng)的模板，使用ABI 3730XL 測(cè)序儀 (Applied Biosystems Co., USA) 進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用CodonCode Aligner 3.71對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行序列拼接，去除引物區(qū)，獲得ITS2 間隔區(qū)序列；使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法對(duì)網(wǎng)上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，去除兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列。用MEGA 4.0軟件對(duì)所有序列分析比對(duì)并進(jìn)行種內(nèi)、種間遺傳距離的計(jì)算。計(jì)算基于Kimura 222 Parameter(K2P) 雙參數(shù)模型。用NJ鄰接法(neighbour-2-joining method, NJ)利用比對(duì)過的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(1000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)各分支的支持率)，來直觀的鑒定各物種。利用Schultz等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)Schultz等[16]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比較

威靈仙藥材三個(gè)基源植物：毛茛科威靈仙Clematischinensis序列長(zhǎng)度分別為230 bp，含有三個(gè)PolyC和一個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為69.9%；棉團(tuán)鐵線蓮Clematishexapetala序列長(zhǎng)度分別為220 bp含有三個(gè)PolyC和一個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為69.5%；東北鐵線蓮Clematismanshurica序列長(zhǎng)度230 bp，含有三個(gè)PolyC和一個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為69.9%。根據(jù)Kimura-2參數(shù)遺傳距離模型計(jì)算得到的序列間遺傳距離，作為藥典收藏威靈仙藥材的三個(gè)基源品種之間的遺傳距離最近，差異最小，威靈仙與棉團(tuán)鐵線蓮，距離值為0.006；威靈仙與東北鐵線蓮，距離值為0.017。金粟蘭科的草珊瑚與威靈仙，棉團(tuán)鐵線蓮和東北鐵線蓮之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，分別為1.083、1.077和1.146。

2.2 種內(nèi)分析

以棉團(tuán)鐵線蓮為例來分析種內(nèi)變異的情況，將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)合從Genbank中下載的兩個(gè)ITS2序列作為3個(gè)種內(nèi)參考序列。比對(duì)后長(zhǎng)度皆230 bp，在151 bp位點(diǎn)的有一個(gè)C-G堿基變異位點(diǎn)。此外，有多個(gè)缺失位點(diǎn)，分別位于1 bp至5 bp、209 bp、222 bp至230 bp位點(diǎn)。種內(nèi)平均K2P變異為0.003，種內(nèi)最大K2P變異為0.005。

2.3 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列種間變異

威靈仙與其主要混偽品ITS2序列間存在較多的變異位點(diǎn)，種間平均K2P距離為0.708。具體種間變異如下圖所示：

(圖1部分，接下頁)

(圖1部分，接上頁)

圖1 威靈仙與其主要混偽品ITS2序列間變異點(diǎn)

2.4 種間聚類分析

本研究發(fā)現(xiàn)，ITS2作為DNA條形碼序列，在聚類分類圖上，威靈仙的三個(gè)基源植物聚在一起，可以有效的鑒別威靈仙基源植物與其易混偽品。鐵線蓮屬的6種植物聚集為一枝，支持率到達(dá)100%，與其他科屬的混偽品，包括草珊瑚、桃兒七、芍藥、毛脈菝葜、土茯苓等植物，都能進(jìn)行很好的區(qū)分，差異非常明顯。而在鐵線蓮屬的6種植物聚集的一枝中，威靈仙藥材正品來源的3種植物聚集為一枝，支持率到達(dá)83%，結(jié)合枝長(zhǎng)方面的信息，非常易于區(qū)分威靈仙藥材來源的正品植物和其他同屬的混偽品種。見圖2。

2.5 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

如圖3所示，威靈仙與其3個(gè)混偽品在二級(jí)結(jié)構(gòu)上有明顯差異。重點(diǎn)差異存在于螺旋Ⅳ中。威靈仙二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅳ基部存在2個(gè)小莖環(huán)中間有1個(gè)中頸環(huán)，而毛蕊鐵線蓮和柱果鐵線蓮2個(gè)物種二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅳ基部的莖環(huán)在大小及位置上均與威靈仙存在明顯區(qū)別。威靈仙二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋I和Ⅲ的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與芍藥存在明顯不同。因此，ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)也可作為鑒定威靈仙及相近種、偽品的一個(gè)方法。

3 討論

傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法如形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)指紋圖譜等鑒定方法，在中藥材鑒定和評(píng)價(jià)其質(zhì)量研究中發(fā)揮了重要作用。但是，中藥飲片、粉末以及含有生藥原型的傳統(tǒng)中成藥的鑒定非常困難，采用形態(tài)鑒定顯然不可取?；瘜W(xué)分析方法研究的是植物內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝產(chǎn)物的含量又受生理?xiàng)l件、采收時(shí)間、貯藏等因素的影響，對(duì)于化學(xué)成分相似的物種就更難以區(qū)分因而傳統(tǒng)方法有一定局限性。

ITS2序列長(zhǎng)度較短，易于擴(kuò)增，作為ITS一部分，被廣泛用于系統(tǒng)進(jìn)化研究[7,8]，也是藥用植物DNA柔形碼鑒定最優(yōu)的序列之一，物種水平的鑒定成功率高達(dá)92.7%。在本研究中，ITS2作為DNA柔形碼序列可以有效的鑒別威靈仙與其混偽品。

結(jié)合三種正品威靈仙的產(chǎn)地來看，威靈仙主要生長(zhǎng)于廣東、云南、四川、陜西、江蘇、安徽等地，棉團(tuán)鐵線蓮主要生長(zhǎng)于江蘇、山東、陜西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等地區(qū)，東北鐵線蓮生長(zhǎng)于東北三省，以及朝鮮、俄羅斯等地區(qū)[20]。綜合地區(qū)分別來看，體現(xiàn)出一種由南向北，分別生長(zhǎng)威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮、東北鐵線蓮的特點(diǎn)，再結(jié)合系統(tǒng)聚類樹中的枝長(zhǎng)信息，在正品威靈仙的單獨(dú)枝內(nèi)部，威靈仙與棉團(tuán)鐵線蓮聚類為一枝，支持率為64%，且枝長(zhǎng)上面，棉團(tuán)鐵線蓮更長(zhǎng)，而東北鐵線蓮的枝長(zhǎng)長(zhǎng)于棉團(tuán)鐵線蓮。根據(jù)中性理論與“分子鐘”理論，結(jié)合以上數(shù)據(jù)，說明并驗(yàn)證了威靈仙最先起始于南方，再向北發(fā)展的過程中，為適應(yīng)不同的環(huán)境條件，出現(xiàn)了種間的變異，最終形成了多種威靈仙。資料顯示，鐵線蓮屬的分布中心在中國(guó)的亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)范圍內(nèi)云南和四川分布的種類最多(包括變種)，然后以此為中心向四周的分布逐漸減少，Helleboroideae起源中心的推測(cè)和鐵線蓮屬古老類群的分布，推測(cè)鐵線蓮屬起源于中國(guó)西南地區(qū)。根據(jù)以上分析，本研究結(jié)果驗(yàn)證了這一現(xiàn)象[21]。綜上所述，ITS2作為DNA條形碼序列不僅能夠較好的區(qū)別中藥材威靈仙基源植物與其混偽品，同時(shí)，對(duì)于探討威靈仙屬不同物種間的進(jìn)化關(guān)系亦能起到重要的參考價(jià)值。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的威靈仙及其混偽品的鄰接(NJ)樹(bootstrap1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)

圖3 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005：528.

[2] 徐濤, 萬德光. 威靈仙本草新考[J]. 中藥材, 2001, 24(4): 293-294.

[3] 楊貴元, 丁永輝, 宋平順, 等. 甘肅省威靈仙藥用植物及商品調(diào)查[J]. 中藥材, 2001, 24(1): 20-21.

[4] 張良發(fā). 威靈仙及其混淆品的鑒別[J]. 湖南中醫(yī)導(dǎo)報(bào), 2000, 6(4): 59-60.

[5] 黎國(guó)英, 林怡如. 威靈仙與桃兒七的鑒別[J]. 實(shí)用中醫(yī)藥雜志, 2004, 20(7): 402-403.

[6] 王均理. 威靈仙及其偽品芍藥須根的鑒別[J]. 基層中藥雜志, 2001, 15(1): 40.

[7] 陳士林, 姚輝, 宋經(jīng)元.等. 基于DNA barcoding(條形碼)技術(shù)的中藥材鑒定[J]. 世界科學(xué)技術(shù), 2007,9(3):7-12.

[8] 陳士林, 宋經(jīng)元, 姚輝, 等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[J].中國(guó)天然藥物, 2009,7(5): 322-327.

[9] Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR. Barcoding animal life: cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related specie [J]. Proc Biol Sci, 2003, 270(S1):S96-S99.

[10] Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, et al. Biological identifi-cations through DNA barcodes[J]. Proc Biol Sci, 2003, 270(1512): 313-321.

[11] Chen SL, Yao H, Han JP ,et al. Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species[J]. PloS One, 2010，5(1): e8613.

[12] Yao H, Song JY, Liu C, et al. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals[J]. PloS One, 2010,5(10): e13102.

[13] Gao T, Yao H, Song JY, et al. Evaluating the Feasibility of Using Candidate DNA Barcodes in Discriminating Species of the Large Asteraceae Family[J]. BMC Evolutionary Biology, 2010, 10: 324-326.

[14] 羅焜, 陳士林, 陳科力,等. 基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究[J].中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué),2010,40(4):342-351.

[15] Pang XH, Song JY, Zhu YJ, et al. Using DNA barcoding to identify species within Euphorbiaceae [J]. Planta Medi, 2010, 76: 1784 -1786.

[16] 朱英杰, 陳士林, 姚輝, 等. 重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào). 2010, 45(3): 376-382.

[18] Pang XH, Song JY, Zhu YJ, et al. Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification [J]. Cladistics, 2010, 26:1-6.

[19] Schultz J, Muller T, Achtziger M, et al. The internal transcribed spacer 2 database-a web server for (not only) low level phylogenetic analyses[J]. Nucleic Acids Res, 2006, 34: 704-707.

[20] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志(第28卷) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1980:156-161.

[21] Hong DY, Pan KY, Turland NJ. Flora of China [S]. Beijing : Science Press ; St. Louis : the Missouri Botanical Garden Press, 2001, 6: 333-386.