全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚生長、非特異性免疫及消化酶活力的影響

馬恒甲，葉金云，郭建林，王友慧，沈斌乾，陳建明，潘 茜

（1.大連海洋大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧大連 116023；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001；3.湖州師范學(xué)院，浙江湖州 3130001）

草魚Ctenopharyngodon idellus屬鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae、雅羅魚亞科Leuciscinae、草魚屬Ctenopharyngodon，是我國最重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，其飼料蛋白源主要為植物性蛋白源[1]。近幾年，由于魚粉供應(yīng)不足，價格不斷上漲，人們廣泛研究用廉價的植物蛋白來替代魚粉作為蛋白源，但植物中含有大量的植酸(phytic acid)及其植酸鹽[2]，植酸的化學(xué)名稱是環(huán)已六醇六磷酸酯，分子式為 C6H18O24P6，分子量為660.08，是一種黃色液體，呈強酸性，易溶于水，其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了它對其它離子有很強的絡(luò)合性，能夠與營養(yǎng)物質(zhì)、無機鹽等形成絡(luò)合物從而阻礙魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[3]，植酸還可以與蛋白質(zhì)和氨基酸形成絡(luò)合物，從而抑制消化酶的活性[4]，是飼料中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子。

植酸酶(phytase)屬磷酸單酯水解酶，可將植酸分解為可利用的無機磷酸鹽和肌醇[5]，已有研究表明，植酸酶能夠使與植酸結(jié)合的內(nèi)原性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等游離出來，提高消化率[6]。但魚類消化系統(tǒng)內(nèi)缺乏內(nèi)源性植酸酶[7]，使其對植物飼料源中的營養(yǎng)物質(zhì)利用率降低，從而抑制體內(nèi)消化酶的活性，影響魚體的生長和健康，所以人們一直對植酸酶在飼料中的應(yīng)用研究十分關(guān)注。

關(guān)于草魚全植物蛋白飼料中添加植酸酶對其生長等影響的研究至今未見報道，本試驗通過在全植物蛋白飼料中添加植酸酶，研究和探討植酸酶對草魚生長、非特異性免疫及消化酶活力的影響，旨在為草魚高效環(huán)保型飼料配方的研制和草魚環(huán)境友好型養(yǎng)殖技術(shù)的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗共設(shè) 5 個試驗組：分別添加 500(S1)、750(S2)、1 000(S3)、1 250(S4)、2 500 U/kg(S5)的植酸酶，設(shè)置2個對照組，對照組1(D1)：全植物蛋白基礎(chǔ)飼料中添加無機磷(Ca(H2PO4)2)，對照組2(D2)：全植物蛋白基礎(chǔ)飼料中不添加植酸酶和無機磷，飼料配方見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ)%)Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets(dry matter basis%)

1.2 試驗魚和飼養(yǎng)管理

試驗魚采用健康的一冬齡草魚魚種，初始體重為(39.68±3.05)g。

養(yǎng)殖試驗在浙江省淡水水產(chǎn)研究所特種水產(chǎn)苗種基地流過式養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，共21個玻璃纖維水族缸(D 150 cm)。將試驗魚隨機分成7組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15尾魚，每天08:30、12:30、16:30定時換水，飽食投飼，保持水缸中無剩余殘餌。每天投飼前換水約30%，連續(xù)充氧，暫養(yǎng)2周后進行養(yǎng)殖試驗，試驗時間為8周，試驗水為自然曝氣的自來水，試驗期間水溫控制在20～25℃，pH為6.9～7.6，溶解氧含量為5～6 mg/L，氨氮含量0.15～0.20 mg/L。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后禁食2 d稱重，并采集試驗樣品。

1.3 樣品采集

每個缸隨機取8尾魚，抽取血液后將血液冷凍離心（3 500 r/min）10 min后取上層血清備用，然后進行解剖，分離出腸道和肝胰臟，將腸道、肝胰臟組織稱重，在冰盤上剔除脂肪及內(nèi)容物，以10倍生理鹽水勻漿，將組織懸液冷凍離心(3 000 r/min)，上清液為粗酶提取物，于4℃冰箱中備用。

1.4 草魚生長指標(biāo)和形體指標(biāo)測定

試驗過程中記錄飼料消耗量，根據(jù)終末體重和初始體重分別計算特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)和蛋白質(zhì)效率(PER)等指標(biāo)。

SGR(%/d)=100×(lnFBW-lnIBW)/t

FCR(%)=FI/(FBW+DBW-IBW)

PER(%)=(FBW-IBW)×100/(FI×PC)

存活率 SR(%)=Nt×100/N0

其中IBW為初始體重，F(xiàn)BW為終末體重，DBW為死亡魚重，F(xiàn)I為攝食量，PC為蛋白質(zhì)含量，N0和Nt分別為初始尾數(shù)和終末尾數(shù)。

1.5 草魚非特異性免疫指標(biāo)的測定

非特異性免疫指標(biāo)中，分別測定超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)活性；血液冷凍離心（3 500 r/min）10 min后取中間層備用；將肝胰臟于10倍魚用生理鹽水中勻漿，冷凍離心(10 000 r/min)10 min后取中間澄清部分測定酶活，置于4℃冰箱中備測。SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測定；AKP活力采用對硝基苯磷酸鹽法(試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所)。

1.6 草魚消化酶活力的測定

蛋白酶活力采用福林-酚試劑 (Folin-phenol)法測定，酶單位活力定義為在pH 7.5，酪蛋白濃度為0.5%，37℃下每min水解酪素產(chǎn)生1 g酪氨酸為一個酶活力單位[8]。

淀粉酶活力采用碘-淀粉比色法，每mg蛋白在37℃與底物反應(yīng)30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位。

脂肪酶活力測定脂肪酶活性測定參照聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法進行；1 g組織中的脂肪酶1 min催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量定為一個活力單位[8]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差 (M±SD)表示，分析采用SPSS16.0 for Windows統(tǒng)計分析軟件，做單因素方差分析(One way-ANOVA)，若有顯著差異后再做組間Duncan’s多重比較，顯著性水平P為0.05。

2 結(jié)果

2.1 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚生長性能的影響

從表2可以看出，全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚的SGR、FCR和PER有一定的影響。當(dāng)植酸酶添加水平大于1 000 U/kg(S3)時，其SGR和PER明顯大于D2、FCR則顯著低于D2(P<0.05)，但其SGR和PER顯著低于D1，F(xiàn)CR則明顯高于D1(P<0.05)。當(dāng)植酸酶含量小于1 000 U/kg時，試驗組的SGR、FCR和PER與D2之間無顯著性差異(P>0.05)。各組之間存活率無顯著性差異(P>0.05)。

表2 各飼料組草魚的特定生長率、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)利用率和存活率Tab.2 Specific growth rate,feed conversion ratio,protein efficiency ratio and survival ratio of grass carp fed on experimental diets

2.2 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚非特異性免疫機能的影響

表3中D1的血清SOD活性顯著高于其它各組(P<0.05)，D2與其他各組之間有顯著性差異(P<0.05)；各組之間血清AKP活性沒有顯著性差異(P>0.05)。S4的肝胰臟SOD活性顯著高于D1和D2；各組之間肝胰臟AKP活性無顯著性差異(P>0.05)。

表3 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚非特異性免疫機能的影響Tab.3 Effects of plant based diets containing different levels of phytase on non-immune of grass carp

2.3 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚消化酶活性的影響

從表4可以看出，當(dāng)植酸酶添加水平大于1 000 U/kg時，草魚肝胰臟中的蛋白酶活性明顯增強，酶活大于其它各組 (P<0.05)；D1、D2和S1之間無顯著性差異(P>0.05)，S2顯著大于2個對照組(P<0.05)，對照組之間無顯著性差異；當(dāng)植酸酶活性大于750 U/kg時，各組之間蛋白酶活性無顯著性差異(P>0.05)，但顯著大于D1、D2和S1；S1的腸道蛋白酶活性最低，且與對照組有顯著性差異(P<0.05)；對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。

當(dāng)植酸酶添加水平大于1 250 U/kg時，肝胰臟中的淀粉酶活性顯著大于D1、D2及S1(P<0.05)，與S2和S3之間無顯著性差異 (P>0.05)；D1的肝胰臟淀粉酶活性最低，與D2、S1及S2之間無顯著性差異 (P>0.05)；腸道中S3的淀粉酶活性最高，且與D1、D2和S1之間有顯著性差異(P<0.05)，試驗組之間無顯著性差異(P>0.05)，對照組的酶活最低，S5與對照組之間有顯著性差異(P<0.05)，但S1、S2及S4與對照組無顯著性差異(P>0.05)，對照組之間也無顯著性差異(P<0.05)。

當(dāng)植酸酶添加水平為大于1 000 U/kg時，其肝胰臟脂肪酶活性顯著大于對照組和S1(P<0.05)，與S2之間無顯著性差異(P>0.05)，但大于S2；D2的酶活最低，與D1、S1之間無顯著性差異(P>0.05)；腸道脂肪酶活性中，S1的酶活最低，并與S3、S4、S5之間有顯著性差異(P<0.05)，S3的酶活最高，與S1、D1之間有顯著性差異(P<0.05)，與其他各組無顯著性差異(P>0.05)。

表4 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚消化酶活性的影響Tab.4 Effects of plant based diets containing different levels of phytase on digestive enzyme activities of grass carp

3 討論

3.1 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚生長的影響

本試驗中，添加無機磷組的蛋白質(zhì)效率最高、飼料系數(shù)最低，且與其它各組有明顯差異（P<0.05），說明磷對草魚生長性能的提高十分重要。有研究表明，在飼料中添加植酸酶可以提高奧尼羅非魚Oreochromis aureus♂×Oreochromis niloticus♀[4]、點帶石斑魚 Epinephelus coioides[9]、尼羅羅非魚 Oreochromis niloticus[10]等的平均日增重和蛋白質(zhì)效率，降低餌料系數(shù)和死亡率。但也有研究發(fā)現(xiàn)植酸酶對韓國石斑魚[11]、大西洋鮭Salmo salar[12]等的生長無顯著影響。劉曉俠等[13]研究表明，添加1 000 U/kg植酸酶能夠有效降低鯽魚Carassius auratus餌料系數(shù)；呂林蘭等[14]研究也發(fā)現(xiàn)飼料中植酸酶添加量1 000 U/kg為時，異育銀鯽Carassius auratus gibelio的平均增重率最大(P<0.05)，這些研究雖然植酸酶添加量相同，但彼此的基礎(chǔ)配方、魚種、植酸酶質(zhì)量與種類、試驗條件等之間的差異對實驗結(jié)果有很大影響，本試驗中添加的是酸性植酸酶，且當(dāng)添加植酸酶的添加水平大于1 000 U/kg時，飼料系數(shù)顯著低于對照組2（D2），蛋白質(zhì)效率顯著提高，說明在添加植酸酶后，草魚的生長性能得到提高。這可能是在添加植酸酶后部分植酸磷得到釋放或有些消化酶被從螯合狀態(tài)中釋放出來從而提高魚體的生長，從表2可以看出對照組1（D1）的總磷含量遠(yuǎn)大于其它各組，這可能是由于魚類在利用磷時通常先利用易于利用的無機磷，當(dāng)無機磷不足時，植酸酶的作用才得以體現(xiàn)。本試驗中，隨著植酸酶添加量的增加草魚的飼料系數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢、蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)上升趨勢，且當(dāng)添加植酸酶的添加水平大于1 000 U/kg時，草魚飼料系數(shù)較D2顯著降低（P<0.05）。

3.2 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚非特異性免疫的影響

植酸酶可與蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成絡(luò)合物，影響某些酶和蛋白質(zhì)的功能和活性，從而對魚的免疫產(chǎn)生一定的影響。AKP是一種膜結(jié)合蛋白，與維持體內(nèi)鈣磷比有關(guān)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，血清AKP活性升高[15]。鄭濤等[7]研究表明，無魚粉飼料中添加植酸酶和磷酸二氫鈣有助于降低AKP活性。但本試驗結(jié)果表明，植酸酶對血清和肝胰臟AKP活性則無顯著性影響，這可能是不同的試驗魚和試驗條件產(chǎn)生不同的試驗結(jié)果，同時，在家禽方面也對血清AKP活性有研究，封偉賢等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在豬飼料中添加酸性植酸酶對豬血清的AKP活性無顯著性差異，此結(jié)果與本試驗結(jié)果類似。

SOD是重要的抗氧化酶之一，在消除自由基、防生物分子損傷方面有十分重要的作用，是保護機體免受傷害的一種關(guān)鍵酶，其活性與生物的免疫水平密切相關(guān)[15]，植酸酶對魚類SOD活性的影響還未見報道。從表3可以看出，雖然試驗組血清SOD活性比添加無機磷(D1)組小，但與D2相比，植酸酶對草魚血清和肝胰臟中SOD活性有一定的提高作用，且當(dāng)植酸酶含量大于1 000 U/kg時其作用比較明顯，從而說明當(dāng)植酸酶含量大于1 000 U/kg時，植酸酶對提高草魚血清及肝胰臟SOD活性有一定的作用，從而有助于草魚非特異性免疫功能的提高。

3.3 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對草魚消化酶活性的影響

魚類消化酶活性是反映其消化性能機理的一項重要指標(biāo)，植酸的絡(luò)合性影響了魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，YOON報道，飼料中的植酸可以降低動物對淀粉的消化率，NYMAN研究表明，大鼠日糧中添加植酸鈉時脂肪的消化率有所降低[3]。宋金彩等[17]研究表明，植酸酶可將與植酸絡(luò)合的蛋白質(zhì)釋放出來，便于消化道分泌的各種蛋白酶作用，同時植酸酶的添加可以解除植酸與內(nèi)源性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶結(jié)合，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。朱麗英等[18]研究表明植酸酶能夠提高異育銀鯽的肝胰臟蛋白酶和脂肪酶，但淀粉酶活性降低，腸道脂肪酶活性增強，但蛋白酶和淀粉酶相對對照組較低。姚瑞清等[19]研究發(fā)現(xiàn)1 000 U/kg植酸酶顯著提高了奧尼羅非魚腸道蛋白酶與淀粉酶活性。張璐等[20]研究表明，飼料中添加植酸酶對鱸魚Lateolabrax japonicus胃和腸道中的脂肪酶和淀粉酶的活性無顯著影響，但是顯著提高了其胃和腸道中蛋白酶的活性，在本試驗中，當(dāng)植酸酶添加添加水平大于1 000 U/kg時，草魚肝胰臟及腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性都顯著提高。植酸酶對草魚肝胰臟和腸道消化酶活性有提高作用，其原因可能是在低pH時，植酸可與蛋白質(zhì)分子的堿性基團結(jié)合，抑制消化酶的活性，而植酸酶可以釋放與其結(jié)合的消化酶，從而提高消化酶的活性[14]；同時，磷的吸收量會影響魚體內(nèi)能量的代謝從而影響魚類消化酶的代謝過程。

4 結(jié)論

試驗表明，全植物蛋白飼料中添加植酸酶能夠提高草魚的特定生長率和蛋白質(zhì)效率、降低飼料系數(shù)，有助于增強草魚的非特異性免疫機能，并有效提高草魚肝胰臟和腸道中的消化酶活性。在本試驗條件下，植酸酶適宜添加量為1 000～1 250 U/kg。

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