超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定4種麻痹性貝類毒素

張小軍，陳雪昌，郭遠(yuǎn)明，梅光明，龍 舉，薛 彬，鄭 斌

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316000）

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisons,PSP)是目前世界上分布最廣的一種貝類毒素[1]。目前在所有的貝類產(chǎn)品食物中毒事件中，麻痹性貝類中毒是公認(rèn)的對(duì)健康危害最嚴(yán)重的類型之一。PSP中以石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neoSTX）、脫氨甲酰基類毒素(neoSTX、dcneoSTX)最為常見。PSP在貝類體內(nèi)呈結(jié)合狀態(tài)，因而貝類攝入此毒素對(duì)自身不會(huì)造成危害；當(dāng)人攝入含麻痹性貝類毒素的食物后，毒素會(huì)迅速釋放并呈現(xiàn)毒性作用，潛伏期僅數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)，癥狀包括四肢肌肉麻痹、頭痛惡心、流涎發(fā)燒、皮疹等，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致呼吸停止[2]。

目前貝類毒素的檢測(cè)方法有小鼠生物測(cè)定法[3-4]、電泳法[5]、高效液相色譜法[6-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]等。在這些檢測(cè)方法中小鼠生物法是目前最常用的方法，由于小鼠生物法缺乏準(zhǔn)確的定量性，且不能對(duì)具體毒素進(jìn)行定性，從而限制了方法的應(yīng)用；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)在近年來被用于麻痹性貝類毒素的測(cè)定。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)4種麻痹性貝類毒素STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX進(jìn)行研究，建立了分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品為貽貝，購(gòu)自舟山市某水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。

麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品:STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX購(gòu)自加拿大海洋生物科學(xué)研究所(NRC)；甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。10 μg/mL PSP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確移取適量PSP標(biāo)準(zhǔn)溶液用3 mmol/L鹽酸水溶液定容至100 mL，溶液-18℃保存。PSP標(biāo)準(zhǔn)使用液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用3 mmol/L鹽酸水溶液逐級(jí)稀釋獲得適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ACQUITY UPLC／QUATTRO Premier XE，Waters公司）；勻漿機(jī)（T18，德國(guó) IKA 公司）；漩渦混合器（MS2，德國(guó) IKA 公司）；高速離心機(jī)(Centrifuge5810，Eppendorf公司)；氮吹儀（N-EVAP112，Organomation公司）；Waters OASIS HLB 固相萃取柱（3 cc/500 mg，Waters公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

稱取5.0 g(精確至0.01 g)勻漿后的貝類試樣至50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸后渦旋混勻30 s，超聲提取5 min，然后5 000 r/min離心5 min，收集上清液于50 mL離心管中。Waters OASIS HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL 0.03 mol/L乙酸水溶液活化，取5 mL上清液過柱，收集濾液過0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱2.1 mm i.d.×50 mm 粒徑1.7 μm；柱溫40℃；樣品溫度10℃；進(jìn)樣量:10 μL；流速0.15 mL/min；流動(dòng)相A為含2 mM乙酸銨和0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈，以70%A和30%B等度洗脫。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件見表1。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring(MRM)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件選擇

PSP是強(qiáng)極性化合物[1]，在普通的C18柱上保留較差，很難將各組分分離。UPLC雖然不能將PSP各組分完全分離，但可以將分析物和雜質(zhì)分離，并將分析物富集。PSP在UPLC上分離富集后，由高特異性的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，仍可達(dá)到定量分析的目的。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同濃度的甲酸和乙酸銨作為水相流動(dòng)相研究比較，采用0.1%的甲酸和2 mM乙酸銨作為水相洗脫液，使PSP目標(biāo)物在1 min內(nèi)出峰，峰型尖銳，顯著提高了靈敏度。STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在貽貝樣品中的加標(biāo)質(zhì)譜離子流圖如圖1所示。

將各PSP標(biāo)準(zhǔn)溶液以1.0 mg/kg的濃度進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，以一級(jí)質(zhì)譜掃描模式獲得母離子的分子離子峰和錐孔電壓；以子離子掃描模式進(jìn)行子離子條件優(yōu)化，獲得定性、定量子離子和碰撞電壓。優(yōu)化后的母離子、子離子的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)見表1。

2.2 線性范圍與檢出限

用 STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制濃度分別為 2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種PSP在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)方法線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 4～0.999 7。將加標(biāo)濃度逐級(jí)稀釋添加于樣品中測(cè)定信噪比，最終按照10倍信噪比來確定該方法中STX、dc－STX、neoSTX、dcneoSTX 定量檢出限均為 10.0 μg/kg。

2.3 回收率與精密度

以紫貽貝為基質(zhì)，分別添加濃度為10.0、20.0、50.0 μg/kg的PSP進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。該方法添加濃度在10.0～50.0 μg/kg之間的回收率為77.4%～90.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.87%～6.37%，表明方法重現(xiàn)性好、精密度高，適用于貝類樣品中麻痹性貝類毒素的檢測(cè)。

圖1 STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在貽貝空白樣品中加標(biāo)20.0 μg/kg的色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank mussel spiked with STX,dcSTX,neoSTX and dcneoSTX at 20.0 μg/kg

表2 貽貝樣品加標(biāo)回收率和精密度Tab.2 Recovery and precision of the method from fortified mussel samples

3 結(jié)論

建立了STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX 4種麻痹性貝類毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，采用BEH C18色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。方法分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可廣泛適用于貝類中麻痹性貝類毒素的測(cè)定。

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