海南島葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲種類鑒定

黃偉明, 陳綿才, 肖彤斌, 王會芳

(1.海南大學環(huán)境與植物保護學院,儋州 571737;2.海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護研究所,?？?571100)

根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的寄主,是影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要因素之一[1-2]。僅從形態(tài)學上來鑒定根結(jié)線蟲的種類較為困難,根結(jié)線蟲酯酶表型的出現(xiàn),為根結(jié)線蟲的分類提供了可靠的分類學特征[3-4]。Powers等描述了5種主要根結(jié)線蟲在線粒體COⅡ和lrRNA之間的基因表現(xiàn)限制性擴增的多態(tài)性,為根結(jié)線蟲的鑒定提供了分子生物學上的證據(jù)[5]。

海南島地處熱帶,是全國重要的冬季蔬菜生產(chǎn)基地,根結(jié)線蟲對蔬菜的為害有逐年加重趨勢,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大損失。由于海南島地理和氣候的特異性,蔬菜根結(jié)線蟲可能存在種的變異,但未見系統(tǒng)鑒定的報道。本研究對采自島內(nèi)4地葫蘆科蔬菜上10個根結(jié)線蟲純化系進行了形態(tài)觀察和同工酶分析以及分子生物學鑒定,旨在明確該地區(qū)葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲的種類與分布,為當?shù)厥卟烁Y(jié)線蟲病的有效治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲采集

線蟲樣本采自儋州、陵水、文昌和瓊海4地顯現(xiàn)根結(jié)癥狀的葫蘆科蔬菜植株。將田間采集的線蟲樣本接種于感病品種番茄上,產(chǎn)卵后挑取單卵各純化2盆,于溫室中培養(yǎng)備用。

1.2 形態(tài)學鑒定

1.2.1 雌蟲主要形態(tài)特征觀察

觀察頭部特征、尾部特征等,共觀測20條線蟲。主要測計的指標為體長、最大體寬、口針長、DGO(背食道腺開口至口針基部球的距離)、口針基部球高、口針基部球?qū)?、中食道球長、中食道球?qū)挕?/p>

1.2.2 2齡幼蟲(J2)形態(tài)觀察及形態(tài)測計

觀察頭部特征、尾部特征等,共觀測20條線蟲。主要測計的指標為體長、最大體寬、口針長、DGO、口針基部球高、口針基部球?qū)?、中食道球長、中食道球?qū)?、尾長、透明尾長和a值(體長/最大體寬)。

1.2.3 會陰花紋的制作及觀察

用挑針在體視顯微鏡下解剖根結(jié),每個種群挑取成熟雌蟲20條移入硬塑料板上清水滴中,剔除雜物并進行修切,清水中清洗3次,然后將包含完整會陰花紋且大小合適的角質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到載玻片上,加蓋玻片。干燥后,在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1.3 同工酶分析

根結(jié)線蟲的酯酶(Est)活性分析參照Esbenshade等的程序[6]。電泳分析采用DYY-13型電泳槽,7%聚丙烯酰胺膠,膠厚1.0 mm,每孔加入10條純化培養(yǎng)的年輕雌蟲酶提取物。后將同一膠在酯酶染色液中染色20～30 min至出現(xiàn)清晰的酶條帶為止。以已鑒定的爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)樣本作為參照系。酯酶表型的命名按照Esbenshade等的方法[7]。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 DNA提取

用純化后的非南方根結(jié)線蟲種群,挑取其卵塊,用1%的次氯酸鈉消毒30 s,然后在清水中30℃孵化5 d,用2 mL滅菌離心管收集孵化的J2懸浮液,5 000 r/min,離心4 min,去上清液。DNA提取方法參照美國Williamson[8]和廖金鈴[9]所介紹的方法稍作修改,采用大量DNA提取法。用鑷子將含J2的離心管投入液氮中30 s后,用與離心管配套的錐形研磨棒,直接用力研磨成粉末,加入700 μ L提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5;50 mmol/L NaCl;5 mmol/L EDTA,pH8.0;0.5%SDS)和 7 μ L的20 mg/mL蛋白酶K,輕輕混勻;50℃水浴4～5 h;加入等體積的Tris飽和酚,輕輕混勻,12 000 r/min,4℃下離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5 mL離心管中;加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),輕輕混勻,12 000 r/min,4℃下離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5 mL離心管中;加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5體積經(jīng)預冷的無水乙醇,輕輕混勻,放入-20℃冰箱中放置2 h;12 000 r/min,4℃下離心10 min以沉淀DNA;沉淀物用75%的乙醇洗滌2次,待乙醇揮發(fā)完全后,將沉淀的DNA溶解于 20 μ L TE(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1 mmol/L EDTA)中;-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物

利用 Powers等[5]設(shè)計的引物#C2F3和 #1108,所用引物的系列如下：5′-GGTCAATGTTCAGAAATT TGTGG-3′和 5′-TACCT T TGACCAATCACGCT-3′,分別位于線粒體 DNA中的 COⅡ基因和lrRNA基因,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4.3 反應體系

2.5 μ L 10×PCR 緩沖液;0.5 μ L dNTP(每一核苷酸為 10 μ mol/L);1 μ L 引物#C2F3;1 μ L 引物#1108;0.5 μ L 5U Taq 酶 ;無菌水 17.5 μ L;DNA懸浮液 2 μ L;共 25 μ L 。

1.4.4 擴增條件

94℃預變性4 min,94℃1 min,51℃1 min,70℃2 min,共35個循環(huán),再在 72 ℃延伸10 min。

1.4.5 電泳

配制1.5%瓊脂糖凝膠,待凝膠冷卻至約55℃時,加入1.5 μ L Goldview 生物核酸染料,混勻后制膠 。取5 μ L PCR 擴增產(chǎn)物與1 μ L 6×DNA 載樣緩沖液混勻上樣;在1×TBE緩沖液中以8 V/cm電壓電泳30 min。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量結(jié)果

通過顯微觀察,對采自4個市縣的10個純化系進行初步的會陰花紋觀察和形態(tài)學測量,發(fā)現(xiàn)有2種不同的會陰花紋。通過測量對比,初步鑒定為南方根結(jié)線蟲(M.incognita)和象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)。象耳豆根結(jié)線蟲雌蟲梨形或球形,無后端突;頭區(qū)和頸區(qū)分界不明顯,唇盤圓盤狀;口針纖細,略向背面彎曲;基部球粗大。J2線形,體前端平截,頭區(qū)與蟲體分離。測量數(shù)據(jù)中,除最大體寬(315～702)與Yang(375.7～809.7)[10]結(jié)果相比偏小,與卓侃(306.0～693.6)[11]測量的值相近,其余值基本相近。南方根結(jié)線蟲雌蟲蟲體膨大,呈球形或梨形,有明顯突出的頸部,唇區(qū)稍突起,略呈帽狀;測量值與趙洪海[12]所測近似。

表1 病原根結(jié)線蟲的形態(tài)學測量數(shù)據(jù) μ m

2.2 會陰花紋觀察

來自儋州、陵水、文昌和瓊海4地根結(jié)線蟲樣本純化出的10個種群中,主要有2種會陰花紋表型,其一主要特征為：整體呈卵圓形至橢圓形,線紋較平滑,背弓常較高,呈方形或近圓形;無明顯側(cè)線;陰門區(qū)一般無線紋,與劉昊[13]描述的象耳豆根結(jié)線蟲會陰花紋形態(tài)一致。另一會陰花紋變異較大：花紋呈橢圓形或近圓形,通常背弓高,背弓頂部圓或平,有時呈梯形,背紋緊密：花紋背面和側(cè)面的線紋呈波浪形或鋸齒狀,有的平滑,側(cè)線不明顯,側(cè)面線紋有時分叉,與南方根結(jié)線蟲的形態(tài)一致。

圖1 海南島葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲種群的代表性會陰花紋形態(tài)(400×)

2.3 同工酶分析結(jié)果

將分離純化的10個種群進行同工酶分析,Est兩條主要酶帶,Rm分別約0.36和0.43,為VS1-S1型,其中 A2和B3中有純化系 Est表型為I1型,Rm約在0.47(圖2,表2)。同工酶表型在以往的研究中證明是可靠的根結(jié)線蟲鑒定證據(jù)[7,13],因此可以斷定,種群2和種群3是南方根結(jié)線蟲與象耳豆根結(jié)線蟲的混合種群,其余為象耳豆根結(jié)線蟲純種群。

圖2 葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲10個純化系的Est電泳圖

表2 海南島葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲的Est表型分析

2.4 分子生物學分析

對5個樣本的Est表型為VS1-S1型純化系進行分子標記分析,結(jié)果如圖3。用引物#C2F3和#1108擴增提取產(chǎn)物,電泳后可得到一在700 bp左右的條帶。此結(jié)果與前人報道的象耳豆根結(jié)線蟲獲得的片段大小相同[11-13]。

圖3 象耳豆根結(jié)線蟲5個純化種群PCR產(chǎn)物電泳圖

3 結(jié)論與討論

本研究運用比較形態(tài)學、同工酶電泳和mtDNA-PCR相結(jié)合的方法對海南島葫蘆科蔬菜上的5個根結(jié)線蟲種群進行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個純化系中,有2個為南方根結(jié)線蟲,其余的為象耳豆根結(jié)線蟲。在海南瓊海的絲瓜、文昌的南瓜、陵水的葫蘆和儋州的絲瓜上均發(fā)現(xiàn)了象耳豆根結(jié)線蟲為害。據(jù)報道,海南地區(qū)的象耳豆根結(jié)線蟲分布在?？凇①僦?、三亞、澄邁和瓊海5個市縣[10-11,13],此次研究結(jié)果增加了2個市縣,分別為文昌和陵水;同時增加了2個新的寄主作物葫蘆和絲瓜[13]。由此可見,象耳豆根結(jié)線蟲在海南島有逐步擴展的趨勢,應引起相關(guān)部門的重視。

象耳豆根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲混合種群的出現(xiàn),是否會導致種群的災變,象耳豆根結(jié)線蟲是否會成為繼4個重要根結(jié)線蟲種類后的又一重大根結(jié)線蟲病原,還有待于進一步研究。

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