葫蘆科主要蔬菜再生體系建立影響因素的研究進(jìn)展

潘瓊玉 田麗波 商桑 黃東梅 周萌萌 王佳楠 鄒凱茜

摘 要 葫蘆科主要蔬菜建立再生體系是基因工程研究中關(guān)鍵性的基礎(chǔ)工作。本文就近些年來國內(nèi)外在激素水平、培養(yǎng)基類型、基因型、苗齡、外植體部位、不同的消毒處理方法等因素對葫蘆科主要蔬菜再生體系建立的影響方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，分析了目前葫蘆科主要蔬菜再生體系研究進(jìn)展緩慢的原因，以期為葫蘆科主要蔬菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究和分子育種提供借鑒。

關(guān)鍵詞 葫蘆科 ；蔬菜 ；離體培養(yǎng) ；再生體系

中圖分類號 S432.45 ；Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.010

Abstract The establishment of regeneration system of Cucurbitaceae was the key job of genetic engineering research. The research development of hormone level， culture medium type， genotype， seedling age and explant site， different disinfection methods and other factors of Cucurbitaceae were summarize， the reason of relatively slow research development of regeneration system of Cucurbitaceae was analyzed， so as to provide reference for the genetic transformation and biotechnology breeding of major Cucubitaceae crops.

Keywords Cucurbitaceae ； in vitro culture ； regeneration system

葫蘆科作物在世界分布廣泛，有110～122屬，775～960種，以熱帶和亞熱帶較多，中國有28個屬，約150個種，該科植物中有一部分瓜類可作盆栽植物供人觀賞，也可作水果蔬菜食用，此外還有一些有獨(dú)特的藥用價值，如苦瓜（Momordica charantia L.）不僅有豐富的營養(yǎng)價值，而且有降血糖[1]、抗菌、抗腫瘤、抗病毒[2]、抗艾滋病等很高的藥用功效[3]；甜瓜（Cucumis melo L.）果實(shí)口感甘甜，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，是公認(rèn)的十大健康水果之一；西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. et Nakai）有清熱解毒、利水消炎的功效，是中國重要的水果類經(jīng)濟(jì)作物；南瓜（Cucurbita moschata （Duch. ex Lam.）Duch.ex Poiret）的維生素A含量，與番茄比較不相上下，是非常受歡迎的蔬菜之一。在眾多的蔬菜中，黃瓜（Cucumis sativus L.）是最受青睞的蔬菜之一，既可以美容養(yǎng)顏又能清熱解毒[4]。

植物的離體再生體系是在人工的條件下，用無菌操作技術(shù)使植物組織或單個細(xì)胞能夠繼續(xù)生長并分化發(fā)育成新的完整植株。植物外植體通過器官發(fā)生途徑，先經(jīng)過愈傷組織階段后分化成再生植株；而通過外植體直接誘導(dǎo)生成不定芽，對于愈傷組織難誘導(dǎo)成苗的物種來說，是一種有效的再生途徑，而且還可以縮短植株的培養(yǎng)周期[5]。但葫蘆科主要蔬菜不定芽的分化率較低，如甜瓜再生率在44.8%～76.00%[6]，西瓜為83.32%[7]，苦瓜為13.3%[8]，黃瓜為83%[9]，南瓜為27.4%～57.5%[10]，可能受多種因素的影響，其中受基因型和植物內(nèi)源激素的影響是主要原因。葫蘆科蔬菜常規(guī)育種的難度大、周期長、遺傳性狀不穩(wěn)定，而利用基因工程技術(shù)對其進(jìn)行品質(zhì)創(chuàng)新和培育出優(yōu)質(zhì)高新的品種[11]是一條有效途徑。葫蘆科蔬菜再生體系的建立是基因工程中轉(zhuǎn)基因植株驗(yàn)證的關(guān)鍵性基礎(chǔ)工作，也是目前研究的熱點(diǎn)，所以有越來越多的學(xué)者展開關(guān)于葫蘆科蔬菜離體再生體系的研究。本文對葫蘆科主要蔬菜離體再生體系建立的研究現(xiàn)狀進(jìn)行概述，主要對影響葫蘆科主要蔬菜再生體系建立的因素進(jìn)行系統(tǒng)分析，為加速葫蘆科主要蔬菜的育種工作提供參考依據(jù)。

1 培養(yǎng)基和激素水平

植物組培中的一個很重要的條件是植物培養(yǎng)基種類和成分。培養(yǎng)基的成分與植物是否能成功生長有直接關(guān)系。生長素和細(xì)胞分裂素能很好地促進(jìn)叢生芽的發(fā)生[12]。影響植物愈傷組織形成的一個重要因素是不同的激素組合配比。

1.1 發(fā)芽培養(yǎng)基

較為常用的13種培養(yǎng)基為White、MS、B5、SH、N6、NN、DKW、WPM、H、Miller、ER、NT、LS[4]。在大部分植物的組培中，實(shí)驗(yàn)人員多采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，沒有發(fā)現(xiàn)專門針對葫蘆科植物組培而設(shè)計的培養(yǎng)基[13]。MS的無機(jī)鹽和離子濃度均較高，養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物營養(yǎng)和生理需要，且其硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基高，可廣泛應(yīng)用于植物器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體的離體培養(yǎng)，效果良好，很多培養(yǎng)基是由MS演變而來的。

1.2 BA和IAA、NAA

高濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）不利于叢生芽的伸長，但一定濃度的吲哚-3-乙酸（IAA）和6-BA組合配比對叢生芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用[14]。潘紹坤等[15]在研究苦瓜再生植株時發(fā)現(xiàn)，加入IAA和吲哚丁酸（IBA）的每個處理的不定芽再生率都很高。王國莉等[16]在2組激素組合MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 玉米素（ZT）+0.1 mg/L 萘乙酸（NAA）中，3種基因型苦瓜的誘導(dǎo)率都是最高的，每10個外植體得到30個左右的叢生芽。羅燕華[14]以苦瓜子葉節(jié)為外植體誘導(dǎo)叢生芽，在培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L IAA+3.0 mg/L 6-BA中，誘導(dǎo)率高達(dá)93.8%（表1）。在2.0 mg/L BA+MS和MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IAA 2種培養(yǎng)基中，薄皮甜瓜子葉的再生能力高達(dá)100%[17]。有實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA時甜瓜的再生率是最高的，當(dāng)6-BA濃度在1.2 mg/L時芽誘導(dǎo)率最高[7]，但是高濃度的6-BA誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽染色體會加倍[18]。而有人用甜瓜子葉近胚軸做外植體，選出了最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA[19]。BA是誘導(dǎo)西瓜子葉外植體分化必不可少的生長調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)子葉叢生芽的BA濃度范圍為1～10 mg/L。IAA、IBA、NAA等生長素類生長調(diào)節(jié)劑常用的濃度范圍為0～3 mg/L。有實(shí)驗(yàn)證明，2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA為誘導(dǎo)西瓜叢生芽的最佳培養(yǎng)基[20]。也有實(shí)驗(yàn)證明，對西瓜不定芽伸長的作用效果最好的是0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA[21]。南瓜愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L BA [22]；南瓜芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA[23]。而有研究發(fā)現(xiàn)，黑籽南瓜叢生芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA[24]。黃瓜對生長素非常敏感，誘導(dǎo)大量的愈傷組織只需用極低濃度的生長素。將黃瓜子葉和下胚軸接種于添加1.0～2.0 mg/L BA+0.01～0.02 mg/L IAA（或NAA）的MS培養(yǎng)基中，子葉能直接分化出芽，不同的品種出芽率不同；下胚軸只誘導(dǎo)出愈傷組織，并沒有芽的分化[25]。而當(dāng)6-BA濃度高于1.0 mg/L時，黃瓜叢生芽誘導(dǎo)率會降低，且會出現(xiàn)畸形。

1.3 其他激素

馮銳等[12]單獨(dú)使用3.0 mg/L激動素（KT）時，苦瓜叢生芽增殖效果為其他激素的4.9倍，且苗健壯，長勢好。也有學(xué)者用噻苯?。═DZ）對苦瓜叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)[26-29]。鄭陽霞等[30]的實(shí)驗(yàn)表明，TDZ、ZT、6-BA對苦瓜叢生苗的誘導(dǎo)都有一定的促進(jìn)作用。Tang等[31]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)用BAP能誘導(dǎo)芽分化。Shaik等[32]用CSH和TDZ搭配添加在MS中誘導(dǎo)苦瓜外植體子葉愈傷組織發(fā)芽。也有學(xué)者用2，4-D對外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)[33-34]。0.01 mg/L IAA和0.2 mg/L KT對西瓜不定芽的伸長率高達(dá)97%[35]。在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L脫落酸（ABA）中黃瓜子葉再生芽誘導(dǎo)率達(dá)50%左右[36]。甜瓜葉片的最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率達(dá)90.0%，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中的出芽率最高，分化率為86.7%[37]。

2 影響不定芽誘導(dǎo)的因素

2.1 基因型

在某些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不定芽誘導(dǎo)還會受植物外植體基因型的影響[38]。王國莉等[16]用3個不同基因型的苦瓜進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明在同樣的條件下，3個苦瓜的叢生芽誘導(dǎo)率都不一樣，但區(qū)別不是很大。有實(shí)驗(yàn)證明在綠色、黃色、黃綠色3種顏色的愈傷組織中，綠色的分化率最低[30]。最合適子葉節(jié)叢生芽誘導(dǎo)時的苦瓜子葉是呈淡綠色的。在西瓜中，黑密5號最容易產(chǎn)生愈傷組織[39]。不同品種甜瓜的不定芽誘導(dǎo)率不同，‘IVF501、‘IVF509、IVF525、‘IVF604的不定芽誘導(dǎo)率分別為88.00%、79.69%、76.50%、74.75%[40]。Todd等[41]用85個黃瓜品種進(jìn)行再生能力的試驗(yàn)，其中只有28個子葉外植體形成芽，出芽率有較大差異。杜勝利等[42]用不同親本來源的12個黃瓜進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果是這12個材料都能誘導(dǎo)產(chǎn)生芽。張衛(wèi)華等[43]用歐美型HL7、華南型Tm和華北型品系做對比試驗(yàn)，結(jié)果顯示前2種基因型再生能力都比第三個品系強(qiáng)，可見基因型對黃瓜再生能力還是有一定影響的。

2.2 苗齡和外植體部位

葫蘆科主要蔬菜的體細(xì)胞發(fā)生途徑是指由單個細(xì)胞或一小團(tuán)細(xì)胞，在特定的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)為胚性細(xì)胞，然后形成球形胚，再經(jīng)過心形、魚雷形、子葉等發(fā)育期，最后形成再生植株的過程。葫蘆科主要蔬菜再生器官的發(fā)生一般是通過間接器官發(fā)生途徑進(jìn)行的。再生植株培養(yǎng)的間接器官發(fā)生途徑過程中有比較明顯的愈傷組織階段，如圖1所示[44]。

在用外植體直接誘導(dǎo)出叢生芽的階段，植物苗齡也是不定芽誘導(dǎo)能否成功的重要因素之一[45]。王國莉等[16]用3個不同生長階段的苦瓜無菌苗進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果證明，苗齡為10 d左右是誘導(dǎo)子葉節(jié)從生芽的最適時期。苗齡為2 d的甜瓜子葉誘導(dǎo)率最高[7]。

不同外植體部位誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織生長速度也存在著差異，這也許是由于作物各個部位激素含量差異導(dǎo)致[46]。羅燕華[14]的試驗(yàn)表明，利用苦瓜的幼葉、胚軸和愈傷組織誘導(dǎo)分化很難，而子葉節(jié)卻可以直接誘導(dǎo)出叢生芽。真葉、上胚軸等外植體愈傷組織生長速度比較緩慢[41]，而子葉、下胚軸和幼根的愈傷組織生長速度快[47]。在西瓜中，很多組織和器官都能作為西瓜的外植體，比如子葉、莖尖、幼葉、頂芽等，但即使是在同一植株上，其誘導(dǎo)率也存在差異[48]。有學(xué)者認(rèn)為，西瓜子葉是不定芽誘導(dǎo)效果最好的外植體[49]，而萬勇等[50]認(rèn)為，頂芽的誘導(dǎo)率高于子葉。前人研究認(rèn)為，南瓜愈傷誘導(dǎo)的最適子葉外植體是嫩綠色的[23]。

2.3 溫度和光照條件

溫度和光照條件對葫蘆科外植體的發(fā)芽率影響不大，培養(yǎng)溫度范圍一般為22～28℃，光照為1 000～3 000 lx，光照時長為12～16 h/d。但是在無菌苗初期要經(jīng)過一段時間的暗處理，待種子露白后再轉(zhuǎn)移到正常的光照條件下。外植體培養(yǎng)初期也要經(jīng)過幾天的暗處理，這樣可有效提升外植體不定芽的發(fā)生率[51-52]。

3 生根、消毒和移栽

3.1 生根培養(yǎng)

Ganasan等[53]報道了IBA在西瓜組培中的生根效果，0.1 mg/L IBA就能達(dá)到100%的促生根效果。武鵬等[8]用MS和1/2 MS作為苦瓜的基本培養(yǎng)基，并在其中分別加入不同濃度梯度的IBA，選出了最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L IBA。馮銳等[12]的試驗(yàn)表明，在MS中加入0.1 mg/L NAA后，苦瓜生根率達(dá)到最高，為100%；在大量元素減半、蔗糖濃度為1%的MS中，生根效果最好，而且，適度降低蔗糖濃度，可以有效控制和改善苦瓜的玻璃化。而鄭陽霞等[30]證明了0.05 mg/L NAA促生根效果最佳。苦瓜的再生植株易于生根，在1/2 MS+0.2 mg/L IAA中就能得到比較高的生根率，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根形態(tài)都比較正常[14]。甜瓜的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.20 mg/L NAA+0.60 mg/L IBA時效果最佳[54]。

3.2 消毒處理

貯藏期長的種子易帶菌[14]。武鵬等[8]用3種不同的方法對3組苦瓜種子進(jìn)行消毒，驗(yàn)證了用10%的次氯酸鈉（NaClO4）單獨(dú)消毒及用0.1%氯化汞（HgCl2）與70%的酒精結(jié)合消毒的效果最好。在無菌條件下，用70%的乙醇溶液對甜瓜種子進(jìn)行消毒1 min，再用8% HgCl2消毒8 min，然后以無菌水沖洗3～5次，這樣消毒效果比較好[7]。同樣在無菌條件下，可用75%的乙醇溶液對西瓜種子進(jìn)行消毒30 s，0.1% HgCl2消毒5～6 min，無菌水沖洗3～4次[55]。也有用70% 酒精和3% NaClO4對西瓜種子進(jìn)行消毒的例子[6]。也可用70%～75%酒精對黃瓜種子消毒3 s，再用4% NaClO4消毒20 min，這也是一種較好的消毒方法[4]。冬瓜種子是用0.1% HgCl2消毒9 min[23]。以上消毒方法都要注意把握消毒時間，時間過長會導(dǎo)致種子受毒害而死亡。

以上幾種葫蘆科作物消毒藥劑都差不多，在試劑濃度上把握好就能安全又有效的做到徹底消毒。

3.3 試管苗的移植

當(dāng)苦瓜試管苗的根長達(dá)到2～2.5 cm時便可以煉苗移栽。每天早晚澆少量水，15 d后統(tǒng)計苦瓜苗的成活率[6-8]。劉冰等[56]認(rèn)為，待黃瓜長出較多根后，開瓶煉苗3 d，然后移植到含消毒基質(zhì)的營養(yǎng)杯中保溫保濕，大約7 d后可移栽到大棚內(nèi)。待西瓜的不定根達(dá)到2 cm左右，將其從組培瓶中取出，并去掉部分葉片，便可以進(jìn)行移栽[57]。甜瓜的試管苗長根14 d后可煉苗，5～7 d后便可移栽[58]。南瓜無菌苗平均發(fā)根2～3根時便可移栽，澆透1/2 MS營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，試管苗就可以恢復(fù)生長[59]。此外，還需注意各種瓜類蔬菜的移栽方式，有些瓜類蔬菜適宜直接移栽，但西瓜就不適宜直接移栽，需通過嫁接才能保證其成活。

綜上所述，葫蘆科主要蔬菜再生率較低，與組織、器官、苗齡及外植體部位、激素配比、培養(yǎng)基種類和基因型等有關(guān)，其中最主要的原因是培養(yǎng)基的激素組合與濃度配比以及葫蘆科瓜類蔬菜的基因型。由于植物外植體的各個部位中內(nèi)源激素濃度不同，所需激素種類和濃度也差異很大。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型植物誘導(dǎo)出再生芽的難易程度不同，同種植物不同品種間的誘導(dǎo)率差異較大。有些瓜類蔬菜在由愈傷組織誘導(dǎo)再生芽的過程中易出現(xiàn)玻璃化和褐化現(xiàn)象，這也是再生率較低的原因之一。

4 前景展望

葫蘆科主要蔬菜是人們?nèi)粘Ｗ钪匾氖卟酥?，其重要?jīng)濟(jì)性狀和品質(zhì)性狀的改良是當(dāng)前研究的重點(diǎn)，利用傳統(tǒng)的育種方法培育新品種周期長、效率低，而將組織培養(yǎng)和基因工程相結(jié)合能快速獲得大量特異種質(zhì)資源和改良目標(biāo)性狀，加速育種進(jìn)程。建立再生體系可為今后的遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)，對葫蘆科主要蔬菜的分子遺傳學(xué)研究和育種工作都具有重要意義。目前離體培養(yǎng)手段已經(jīng)用于葫蘆科主要蔬菜的品種改良、快速繁殖以及遺傳轉(zhuǎn)化，但是還存在著一些問題，比如，雖然應(yīng)用此手段建立的西瓜、甜瓜、黃瓜中再生體系比較完善，但將此手段應(yīng)用于其他瓜類中的研究則進(jìn)展緩慢，離體再生體系建立成功的例子比較少，不定芽再生率低，無法在目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行應(yīng)用，目前多利用擬南芥這種模式植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，但顯然這不是最直接的驗(yàn)證手段，今后還需重點(diǎn)探討影響不定芽分化的主要因素，加強(qiáng)這類蔬菜的不定芽分化與激素水平變化的關(guān)系研究，深層次挖掘培養(yǎng)基的成分配比及基因型與不定芽分化之間的關(guān)系，探討葫蘆科主要蔬菜不定芽再生的新途徑等。

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