豬繁殖和呼吸綜合征病毒GP3蛋白糖基化位點(diǎn)突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

劉歡歡，周艷君，姜一峰，張善瑞，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，仔豬發(fā)熱、呼吸困難、腹瀉、消瘦及高死亡率為特征的疾病[1]。2006年爆發(fā)的由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的“豬高熱綜合癥”更是對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，至今仍是影響中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一[2-5]。

PRRSV 為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約15 kb，含有9個(gè)開放閱讀框。ORF2-ORF7 分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M 和 N。其中 GP5、M、N 為主要結(jié)構(gòu)蛋白[6]；GP2a、GP3、GP4、GP5為糖基化的囊膜蛋白。GP3 是 PRRSV 中糖基化程度最高的蛋白, 歐洲型和北美洲型 PRRSV之間， GP3 的氨基酸同源性為54%～60%[7]。分析預(yù)測(cè)顯示GP3蛋白含有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)在不同毒株間均很保守[8]。GP3 與 GP2a 與 GP4 形成異源三聚體包裝入病毒粒子，缺失這三種蛋白的病毒粒子會(huì)失去感染性[9]。

病毒的糖基化與病毒對(duì)細(xì)胞的吸附，病毒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫原性等密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)糖基化修飾的蛋白在病毒感染時(shí)能介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞融合（如副粘病毒的F蛋白），而且某些特定位點(diǎn)的糖基化與副粘病毒蛋白的生物活性密切相關(guān)[10]。糖基化修飾還能使病毒某些重要的抗原表位被糖鏈遮蓋，引起病毒的免疫逃逸現(xiàn)象，如人免疫缺陷病毒的 gp120 糖蛋白，因糖基化位點(diǎn)上的糖鏈遮蓋中和抗原表位導(dǎo)致中和抗體不能將其識(shí)別[11]。

研究表明突變不同的糖基化位點(diǎn)，會(huì)對(duì)病毒的拯救以及病毒在細(xì)胞上的生長(zhǎng)造成影響。關(guān)于GP3 蛋白糖基化的研究中，2007年有報(bào)道證實(shí)，PRRSV FL12株GP3蛋白中有5個(gè)位點(diǎn)（N-29、N-50、N-131、N-152、N-160）是被糖鏈修飾的，而 N42 和 N195 位不存在糖鏈，不是真正的糖基化位點(diǎn)[12]。 2010年，Das 等[13]研究指出 GP3 蛋白的 N195 位點(diǎn)沒(méi)有糖鏈；N42A、N50A 或 N131A單個(gè)位點(diǎn)的突變都不能拯救出病毒，意味著這幾個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒粒子的形成來(lái)說(shuō)是必須的；N29A、N152A或N160A位點(diǎn)的突變不影響感染性病毒粒子的產(chǎn)生；對(duì)GP3糖基化位點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)突變顯示，N29A/N152A、N29A/N160A、N152A/N160A、N29A/N152A/N160A多點(diǎn)突變后的 cDNA克隆都能拯救出病毒，但對(duì)生長(zhǎng)速度有影響，其中N29A/N152A/N160A突變病毒與只含兩點(diǎn)突變的毒株相比，生長(zhǎng)更為緩慢并且滴度降低。 2011年Vu等[14]證實(shí)GP3的N131糖基化位點(diǎn)與GP5上的糖基化位點(diǎn)起著相同的作用，即保護(hù)病毒逃避宿主的中和抗體。

GP3蛋白的糖基化位點(diǎn)在不同亞型的毒株中均保守，因此對(duì)其糖基化位點(diǎn)的研究具有普遍意義。本實(shí)驗(yàn)選取高致病性 PRRSV 的致弱毒株HuN4-F112[15]GP3蛋白的5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行單位點(diǎn)和多位點(diǎn)進(jìn)行去糖基化改造，在全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上拯救病毒，通過(guò)拯救病毒生物學(xué)特性的變化來(lái)探究這些糖基化位點(diǎn)的作用。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株與抗體 PRRSV HuN4-F112株、BHK和MARC-145細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PRRSV 的N蛋白單抗[16]均有本實(shí)驗(yàn)室保存；HuN4-F112株感染性分子克隆由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存[17]；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自中山金橋公司（北京）。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)于QIAGEN公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ambion） 反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Asc I和Swa I、dNTP混合物、DNA Marker等均購(gòu)自大連寶生物有限公司；PFX高保真聚合酶購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)HuN4-F112株GP3蛋白的基因序列，對(duì)其潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行在線分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），結(jié)果顯示該株GP3蛋白存在7個(gè)糖基化位點(diǎn)。用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)N29、N42、N50、N131位糖基化位點(diǎn)突變的引物，將預(yù)測(cè)位點(diǎn)中的氨基酸由N（AAT）突變?yōu)镼（CAG/CAA），同時(shí)設(shè)計(jì)ORF3片段鑒定引物（P3u/P3d）（見(jiàn)表1），所有引物均送由上海Invitrogen公司合成。

1.4 突變?nèi)L(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建 引物中含有待突變的糖基化位點(diǎn)，以質(zhì)粒為模板，采用環(huán)式定點(diǎn)PCR的方法進(jìn)行突變以獲得包含突變位點(diǎn)的雙鏈質(zhì)粒。將序列正確（已包含所需突變）的質(zhì)粒及F-112株全長(zhǎng)質(zhì)粒經(jīng)Asc I和Swa I雙酶切，電泳后凝膠回收，用T4 DNA連接酶將兩片段進(jìn)行連接。連接好的重組質(zhì)粒再經(jīng)酶切和序列分析鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行線性化。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的PRRSV HuN4-F112株感染性克隆在3'末端引入了SwaI酶切位點(diǎn)，經(jīng)SwaI酶切后將包含全長(zhǎng)的質(zhì)粒由環(huán)狀變?yōu)榫€性以備轉(zhuǎn)染。

表1 糖基化位點(diǎn)突變引物及鑒定引物Table 1 Primers for mutation of glycosylation sites and sequence qualification

1.5 病毒的拯救

1.5.1 體外轉(zhuǎn)錄 按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMessage High Yield Capped RNA Taanscription kit 說(shuō)明，對(duì)已線性化的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

1.5.2 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d預(yù)先準(zhǔn)備好BHK細(xì)胞，將細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%，用DMRIE-C試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先將鋪好的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，取12 μL DMRIE-C試劑加入到1 mL OPTI-MEM的EP管中，混勻后加入2.5～5 μg轉(zhuǎn)錄好的RNA，混勻后立即加入到洗滌過(guò)的細(xì)胞中，然后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液，再加入2%～3%FBS的細(xì)胞維持液。24 h后收取細(xì)胞，-80℃保存。所有突變克隆均經(jīng)3次轉(zhuǎn)染。

1.5.3 病毒傳代 病毒傳代前1 d，預(yù)先將MARC-145細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，取凍溶后的BHK-21細(xì)胞離心取上清接入六孔板內(nèi)。置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃孵育5 h后換2%～3%細(xì)胞的維持液。每5 d為一代次進(jìn)行拯救病毒傳代培養(yǎng)，傳至第5代收取病毒。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 間接免疫熒光 轉(zhuǎn)染72 h后，棄去維持液培養(yǎng)基。用冰甲醇固定10 min，1%BSA室溫封閉30 min，用PRRSV的N蛋白特異性單抗37 ℃孵育2 h，PBS洗3遍后再加入FITC標(biāo)記羊抗鼠的二抗，37 ℃避光孵育1 h，用PBS洗5遍后，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照。

1.6.2 重組病毒序列測(cè)定 將拯救的病毒提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，用P3u/P3d引物擴(kuò)增GP3蛋白相應(yīng)片段，目的條帶凝膠電泳后回收與T載體連接,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.7 拯救病毒的生物學(xué)分析

1.7.1 拯救病毒TCID50的測(cè)定 將待檢樣品用培養(yǎng)液做10倍系列稀釋后，將稀釋度為10-1到10-10連續(xù)稀釋的病毒接種到鋪好并長(zhǎng)至單層的Marc-145細(xì)胞96孔培養(yǎng)板內(nèi)。每個(gè)稀釋度接種8孔，即做8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)兩組陰性對(duì)照（用維持液代替病毒液）。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每隔12 h觀察細(xì)胞，記錄CPE情況。 結(jié)果依據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.7.2 細(xì)胞病變的觀察 將拯救的病毒及親本毒株以1MOI感染MARC-145細(xì)胞，48 h后觀察細(xì)胞病變情況。

1.7.3 生長(zhǎng)曲線的繪制 拯救病毒以0.1MOI感染MARC-145細(xì)胞，分別在感染后12、24、36、48、60、72、84、96 h收取100μL細(xì)胞上清液，用半數(shù)感染量（TCID50）計(jì)算病毒滴度，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)病毒的滴度繪制病毒多步生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 拯救PRRSV的鑒定 在構(gòu)建HuN4-F112病毒感染性分子克隆時(shí)，曾將基因組第14 680位的A沉默突變?yōu)镚，產(chǎn)生一個(gè)Mlu I酶切位點(diǎn)作為鑒定拯救病毒的分子標(biāo)記。在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)此酶切位點(diǎn)前后區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物，以拯救出來(lái)的突變體病毒RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Mlu I酶切鑒定。結(jié)果顯示拯救出來(lái)的PRRSV均為HuN4-F112病毒感染性分子克隆衍生的毒株，而非野毒感染（圖1）。

2.2 拯救PRRSV特異性RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 用PRRSV ORF5和Nsp2基因特異性引物對(duì)拯救出的五代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q突變體均為陽(yáng)性，N29Q/N42Q、N29Q/N131Q、N29Q/N50Q/N131Q、N29Q/N42Q/N50Q/N131Q/N195Q均為陰性（圖2）。

2.3 序列測(cè)定結(jié)果 通過(guò)對(duì)拯救病毒RT-PCR分析，PCR產(chǎn)物連接到T載體后獲得單個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定，所得的6株病毒序列中GP3蛋白相應(yīng)位置糖基化位點(diǎn)均由N（AAT）變?yōu)镼（CAG），表明去糖基化突變成功(圖3)。

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 將上述PCR及酶切鑒定正確的6株病毒用PRRSV N蛋白單抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示在六株拯救病毒中均可見(jiàn)強(qiáng)烈熒光(圖4)。

2.5 細(xì)胞病變 拯救病毒以1MOI接種MARC-145細(xì)胞，48 h后觀察細(xì)胞病變，除N50Q外均可見(jiàn)細(xì)胞存在崩解、脫落、形態(tài)不規(guī)則等典型細(xì)胞病變（圖5）。細(xì)胞病變結(jié)果與親本HuN4-F112株引起的細(xì)胞病變基本一致。

2.6 拯救病毒的滴度 采用96孔組織培養(yǎng)板方法對(duì)第五代拯救病毒進(jìn)行感染性滴度的測(cè)定。10倍梯度稀釋病毒原液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9）后接種 MARC-145 細(xì)胞，結(jié)果用Reed-Muench法計(jì)算后如表2。

圖4 PRRSV N蛋白間接免疫熒光檢測(cè)拯救病毒結(jié)果Fig.4 Identification of the rescued viruses with monoclonal antibody against N protein of PRRSV

圖5 拯救病毒接種MARC-145細(xì)胞48 h后出現(xiàn)細(xì)胞病變Fig.5 The CPE of MARC-145 cells 48 hours after infected with rescued viruses

表2 拯救病毒的TCID50Table 2 TCID50 of the rescued viruses

2.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 96孔組織培養(yǎng)板方法進(jìn)感染滴度的測(cè)定，取拯救毒株及HuN4-F112株不同時(shí)段的病毒上清液，測(cè)得的半數(shù)細(xì)胞感染量繪制成生長(zhǎng)曲線（圖7）。結(jié)果顯示拯救的N42Q、N29Q、N29Q/N195Q在生長(zhǎng)趨勢(shì)上與HuN4-F112株存在一個(gè)多滴度的差別, 而N50Q株感染至48 h才出現(xiàn)病變，較親本毒株生長(zhǎng)明顯延遲。

3 討論

病毒的囊膜糖蛋白通常具有抗原性，可以選擇性地識(shí)別宿主細(xì)胞受體并與之結(jié)合，使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，進(jìn)而侵入宿主細(xì)胞[18]。如流感病毒HA蛋白能識(shí)別宿主細(xì)胞表面的糖鏈?zhǔn)荏w,糖鏈末端的唾液酸是流感病毒的結(jié)合位點(diǎn)[19,20],通過(guò)這種識(shí)別和結(jié)合，病毒得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增殖。本實(shí)驗(yàn)中拯救的六株病毒TCID50均低于親本毒株，并且以單點(diǎn)突變株N50Q滴度變化最大，所有拯救突變體病毒生長(zhǎng)曲線較母本毒株也均有較大差異，一種可能的解釋就是糖基化位點(diǎn)的消失改變了囊膜蛋白GP3上受體識(shí)別位點(diǎn)的構(gòu)象，使病毒與宿主細(xì)胞的融合及進(jìn)入細(xì)胞的效率和能力降低，導(dǎo)致病毒的滴度下降。

2007年有研究指出美洲型PRRSV FL12株GP3蛋白的N42、N50、N131位糖基化位點(diǎn)突變的cDNA克隆無(wú)法拯救出活病毒，證明這些位點(diǎn)對(duì)病毒粒子的形成至關(guān)重要，然而在本實(shí)驗(yàn)中這三個(gè)糖基化位點(diǎn)均可以拯救出病毒，與以往報(bào)道有所不同。GP3蛋白的7個(gè)糖基化位點(diǎn)在兩種基因型的PRRSV之間均非常保守，但這三個(gè)位點(diǎn)在不同亞型的毒株間作用不盡相同，可見(jiàn)糖鏈在病毒蛋白的生物學(xué)功能的發(fā)揮中起著復(fù)雜而獨(dú)特的作用。

從拯救病毒的滴度和生長(zhǎng)趨勢(shì)的分析中發(fā)現(xiàn)：拯救病毒（除N131Q外）的TCID50較親本毒株有所降低，多步生長(zhǎng)曲線中各時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)趨勢(shì)也呈下降趨勢(shì)，其中N42Q、N29Q、N29Q/N195Q突變體比母源毒均下降1個(gè)滴度以上，N29Q/N50Q下降約2個(gè)多滴度，而N50Q突變體與親本毒株相比下降近6個(gè)滴度；拯救出的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)突變體與單位點(diǎn)突變體病毒滴度上差異不顯著，拯救病毒N29Q/N50Q的滴度反而高于N50Q，可見(jiàn)29、50兩個(gè)單點(diǎn)突變與29/50、29/195兩個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變相比病毒滴度沒(méi)有明顯差別； N50Q病毒的生長(zhǎng)趨勢(shì)較親本株差異顯著，該株病毒感染48 h后才開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，與親本株48 h后達(dá)到滴度高峰相比生長(zhǎng)明顯延遲，推測(cè)N50位糖基化位點(diǎn)在病毒對(duì)細(xì)胞的侵入及病毒粒子的形成中發(fā)揮著重要作用。

在本研究中一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)的突變株均能拯救出病毒，但將多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變有些則無(wú)法拯救出病毒。糖基化位點(diǎn)N29Q和N42Q單位點(diǎn)突變后病毒均能成功拯救，而N29Q/N42Q同時(shí)突變則不能拯救出病毒。同樣，N29Q、N131Q位糖基化位點(diǎn)單個(gè)突變均能獲得病毒，同時(shí)突變這兩個(gè)位點(diǎn)則不能，這一現(xiàn)象也發(fā)生在將N29Q、N50Q、N131Q三個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變對(duì)病毒的拯救中。對(duì)無(wú)法拯救出病毒的質(zhì)粒序列測(cè)定，除相應(yīng)突變的糖基化位點(diǎn)存在改變外，其他序列與親本株一致。一種可能的推測(cè)是在PRRSV中GP3蛋白中也可能存在一個(gè)糖基化位點(diǎn)的變化影響著另一個(gè)位點(diǎn)糖鏈的修飾，一個(gè)位點(diǎn)的改變通過(guò)空間位阻效應(yīng)影響著其它位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和被修飾的形式，從而導(dǎo)致整個(gè)蛋白糖基化種類的變異以致生物學(xué)功能發(fā)生改變。另一種可能是單個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒的影響是相對(duì)微弱的，改變這一位點(diǎn)的構(gòu)象，其他位點(diǎn)會(huì)發(fā)揮代償性作用，所以單個(gè)糖基化位點(diǎn)不具有決定性。但多個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變導(dǎo)致病毒的蛋白包裝、折疊、修飾等加工過(guò)程改變，這種改變是多點(diǎn)同時(shí)變化造成的，沒(méi)有其它位點(diǎn)代償性機(jī)能的發(fā)揮。最終會(huì)使病毒無(wú)法識(shí)別和結(jié)合受體，不能將病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合等，從而使病毒喪失了產(chǎn)生子代的能力。

本研究著眼于次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3，發(fā)現(xiàn)分別突變?cè)摰鞍咨螻29Q、N42Q、N50Q、N131Q位糖基化位點(diǎn)突變都能拯救出病毒，但是會(huì)影響病毒在MARC-145細(xì)胞上的生長(zhǎng)，且N50Q位突變對(duì)病毒影響最大。同時(shí)突變兩個(gè)以上位點(diǎn)則不能拯救出病毒，可見(jiàn)多個(gè)糖基化位點(diǎn)的同時(shí)存在對(duì)產(chǎn)生子代病毒粒至關(guān)重要。本研究闡釋了次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3糖基化對(duì)病毒影響，希望能為后續(xù)研究糖基化對(duì)PRRS病毒粒子形成、致病性及免疫逃逸等方面的影響提供思路和依據(jù)。

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