酸性條件下Al3+對苜蓿根瘤菌溶磷和分泌生長素能力的影響

張媚佳，歐冰雷，徐蘇凌，方 勇，徐根娣

（1.浙江師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 金華 321007；3.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

磷是植物生命活動所需的大量營養(yǎng)元素之一。我國大多數(shù)農(nóng)田土壤磷素含量豐富，但95%以上以無效態(tài)積累于土壤中[1]，很難被植物直接吸收利用。目前，向土壤中施加可溶性磷肥是提高作物產(chǎn)量最常用的方法，但該法卻不能從根本上解決土壤缺磷的問題，而且還會造成環(huán)境污染。研究表明，利用土壤中天然存在的具有溶磷能力的溶磷菌是避免土壤磷污染和解決植物生長缺磷問題的最經(jīng)濟有效的方法。此外，有些溶磷菌還兼具分泌植物生長素（IAA）的功能，對植物生長起到了直接的促進作用[2-3]。

苜蓿根瘤菌是一種良好的生物肥料[4-5]，同時還具有溶磷和分泌IAA的能力[6-7]。目前已有低pH和鋁脅迫對苜蓿根瘤菌生長狀況的影響的報道，但對低pH下鋁脅迫對苜蓿根瘤菌溶磷和分泌IAA能力的影響的研究卻不多。本試驗從生長在金華酸性紅壤上的紫花苜蓿的根瘤中分離篩選出兩株根瘤菌S1002和S1007，并以此作為供試菌株，探究了酸性條件下Al3+對根瘤菌S1002，S1007溶解有機磷、無機磷和分泌IAA的能力的影響，旨在為根瘤菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試根瘤菌取自金華紅壤區(qū)種植的紫花苜蓿上的根瘤。菌株由實驗室分離純化[8-9]，經(jīng)耐酸篩選后[10]獲得了在pH 5.0的YMA固體培養(yǎng)基上長勢最優(yōu)的兩個菌種S1002和S1007作為研究對象。

1.1.2 培養(yǎng)基 有機磷測定培養(yǎng)基采用蒙金娜有機培養(yǎng)基，配方見參考文獻[11]；無機磷測定培養(yǎng)基采用PKO（Pikovskaia’smedium）無機培養(yǎng)基，配方見參考文獻[11-12]；根瘤菌分泌IAA的能力的測定培養(yǎng)基采用改良的剛果紅液體培養(yǎng)基[11]；根瘤菌保存培養(yǎng)基采用YMA固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 酸性條件下Al3+對根瘤菌溶磷能力的影響采用溶磷圈法進行溶磷能力的測定。在PKO和蒙金娜的液體培養(yǎng)基中（pH 5.0）分別添加0、3、6、9 μmol/L的AlCl3，添加2%的瓊脂粉，經(jīng)高壓滅菌后制成平板備用。將已制備好的根瘤菌懸液用無菌移液槍在無菌條件下點接到PKO和蒙金娜培養(yǎng)基上，每板點植5個點，每個菌種重復(fù)3次，于28℃下培養(yǎng)。10 d后測量根瘤菌菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D），計算根瘤菌菌落溶磷透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值，根據(jù)（D/d）值的大小來判定酸性條件下Al3+對兩種根瘤菌溶磷能力的影響。

1.2.2 酸性條件下Al3+對根瘤菌分泌IAA能力的影響 采用Salkowski比色法[13]作根瘤菌分泌IAA能力的定性測定。在剛果紅液體培養(yǎng)基中（pH 5.0）分別添加0、3、6、9μmol/L的AlCl3，等量分裝到150 mL的三角瓶中，經(jīng)高壓滅菌后備用。用移液槍在無菌條件下移取等量的根瘤菌懸液至各三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速125 r/min，溫度28℃的搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，取其菌懸液100μL滴于白色陶瓷板上，加100μL的比色液，在室溫下靜置15 min后觀察顏色變化，每個菌種3個重復(fù)。3個重復(fù)均變紅為陽性，表示能分泌IAA，顏色越深表明分泌量越多，3個重復(fù)均不變色為陰性，表示不分泌IAA。

用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來作根瘤菌分泌IAA能力的定性分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用純3-IAA制作[14]。根瘤菌的測定是將根瘤菌懸液取出后，在10 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加比色液在黑暗中靜置0.5 h，取出立即在波長530 nm下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到IAA的分泌量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel2003進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性條件下Al3+對根瘤菌溶磷能力的影響

菌株的溶磷圈直徑（D）和菌落生長直徑（d）的比值（D/d）是表征菌株的溶磷效果的重要指標(biāo)[15-16]。從圖1可以看出，分離篩選出的兩個菌株S1002和S1007都能溶解有機磷和無機磷，且溶解無機磷的能力強于有機磷。在相同條件下，S1007的溶磷量大于S1002，表明菌株S1007具有更優(yōu)的溶磷效果。隨著Al3+濃度的增加，S1002和S1007的溶磷量降低，表明兩種菌株對Al3+有一定的耐受性，但其溶磷作用受到了抑制。

圖1 兩種根瘤菌在不同Al3+濃度下的溶磷量

2.2 酸性條件下Al3+對根瘤菌分泌植物IAA能力的影響

通過試驗對兩種耐酸根瘤菌分泌植物IAA能力進行了定性和定量的測定。結(jié)果如表1所示，在Al3+濃度較低的情況下，菌株S1002和S1007仍具有分泌IAA的能力，但隨著Al3+濃度的增加，IAA的分泌量減少，當(dāng)Al3+濃度達到9μmol/L時，不能觀察到顯色變化。

表1 兩種苜蓿耐酸根瘤菌分泌IAA的能力

定量測定結(jié)果與定性測定結(jié)果基本一致（圖2）。隨著Al3+濃度的增加，兩者的IAA分泌量減少，但在Al3+濃度為9μmol/L時，定量測定時仍可檢測到IAA，該結(jié)果與定性測定結(jié)果不一致，這表明IAA需要累積到一定量時才能通過Salkowski比色法檢測到。由此可見，定量測定的結(jié)果更為準(zhǔn)確。

3 討論

圖2 兩種根瘤菌在不同Al3+濃度下的IAA分泌量

近年來，已有眾多學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿根瘤菌具有促進苜蓿、小麥[17]、燕麥[18]、雞骨草[19]等多種植物生長的作用。在中性條件下，部分苜蓿根瘤菌不僅具有固氮活性，而且還具有溶磷作用[11]。本試驗采用溶磷圈法，以分離得到的兩株在pH 5.0的TMA培養(yǎng)基上生長最優(yōu)的根瘤菌菌株作為研究對象，探究了酸性條件下Al3+對兩種根瘤菌溶磷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）兩個菌株都具有較強的溶磷能力，且溶解無機磷的能力強于溶解有機磷的能力，這可能是因為苜蓿根瘤菌的共生特性使之傾向于與無機體結(jié)合，因而強化了溶解吸收有機體營養(yǎng)元素的能力。（2）酸性條件下Al3+的存在對兩個菌株的溶磷作用均具有一定的抑制作用，且這種抑制作用隨著Al3+濃度的增加而增強，但當(dāng)Al3+濃度增加到9μmol/L時，兩個菌株的溶磷量卻增加了。分析原因可能是因為隨著Al3+濃度升高，毒害作用增強，進一步刺激根瘤菌分泌出了檸檬酸等具有解鋁毒作用的酸，從而減小了Al3+對根瘤菌的毒害作用，對其溶磷的抑制作用也相應(yīng)的降低[20]。

本試驗采用Salkowski比色法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對根瘤菌在不同Al3+濃度下分泌植物IAA的量分別進行了定性和定量的測定，發(fā)現(xiàn)兩種苜蓿根瘤菌在酸鋁脅迫下仍具有較強的分泌IAA的能力。在酸性條件下，Al3+對兩種根瘤菌分泌IAA具有抑制作用，且這種抑制作用隨著Al3+濃度的增加而增強。此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，S1007分泌IAA的能力大于S1002，分析原因可能是因為S1007的生長較S1002旺盛，因而分泌IAA的效率更高，產(chǎn)量更多。

綜上所述，菌株S1002和S1007均具有較為優(yōu)異的溶磷和分泌IAA的能力，且溶解無機磷的能力更強；溶磷和分泌IAA的能力都會受到Al3+的影響，Al3+濃度增加，抑制作用增強；菌株S1007的溶磷和分泌IAA能力均較S1002強，表明菌株S1007的性能更優(yōu)。

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