高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量*

張?jiān)?，?進(jìn)，陳 濤，李鳳麗

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花[1]。又名銀花、金花、忍冬花、金藤花等。其味甘,性寒,具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效,臨床常用于治療肺炎、急性痢疾、嬰幼兒腹瀉、宮頸糜爛、眼科炎癥等。金銀花中含揮發(fā)油、黃酮類、三萜類、有機(jī)酸、苷類、微量元素等成分，其主要活性成分是綠原酸以及以木犀草苷為代表的黃酮類成分[2]。目前常規(guī)的檢測(cè)方法是分別采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定綠原酸和木犀草苷的含量，增加了檢測(cè)工作量,且色譜峰不易分開，峰形、分離度也不理想。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)檢測(cè)金銀花中兩種成分的含量，在此色譜條件下兩種成分分離完全，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，快速易行，可為金銀花的質(zhì)量控制提供一定的參考[3]。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 儀器：美國Waters高效液相色譜儀，Waters600E泵，2998二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD），Waters Empower工作站；超聲波清洗器TCQ250（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；電子分析天平JA2003（上海精科天平廠）等。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品（110753-200413），木犀草苷對(duì)照品（111720-200905），由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純；水為重蒸水,自制；其他試劑均為分析純。

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾及初開的花，山東平邑縣產(chǎn)（10060）。

2 條件與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Xterra@PR185（46nm×250nm，5 μm）；Waters In-Line 脫氣機(jī)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%冰乙酸，二元梯度洗脫，0～15 min，乙腈10%～20%，15～30 min，乙腈 20%～25%，30～40 min，乙腈 25%～35%,40～45 min，乙腈 35%～10%；流速 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 350 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)算應(yīng)不低于1 000，理論塔板數(shù)按木犀草苷計(jì)算應(yīng)不低于20 000。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定對(duì)照品綠原酸、木犀草苷適量，加70%甲醇制成1 mL含綠原酸36.4μg，含木犀草苷44.4μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取金銀花細(xì)粉（過4號(hào)篩）約2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)?0%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

按以上色譜條件得到對(duì)照品、金銀花色譜圖。見圖 1、圖 2。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 金銀花樣品色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸、木犀草苷對(duì)照品，加70%甲醇制成1mL含綠原酸3.52mg和1 mL含木犀草苷0.19mg的溶液，作為儲(chǔ)備液,再分別精密量取 5、10、15、20 mL，置 25 mL 量瓶中，加 70%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述4種濃度的對(duì)照品溶液與儲(chǔ)備液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積（RSD），以對(duì)照品濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：綠原酸：Y=41 019.10X+45 849.75，r=0.999 9；木犀草苷：Y=2 537.98X+269.08，r=0.999 5。結(jié)果表明線性良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，10 μL/次，測(cè)定峰面積綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD值分別為1.0%和1.1%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批金銀花樣品（山東產(chǎn)）2 g按“2.3”項(xiàng)下方法提取，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中綠原酸、木犀草苷的峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD分別為為1.90%和2.3%，符合要求。

2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批金銀花樣品（山東產(chǎn)）2 g按“2.3”項(xiàng)下方法提取，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定含量。平行操作6份,計(jì)算綠原酸、木犀草苷平均含量分別為 1.840%（RSD＝2.0%）、0.095%（RSD＝2.32%）符合要求。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3供試品溶液”項(xiàng)下，按“2.1 色譜條件”項(xiàng)下于配置 0、1、2、4、6、12 h 分別進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD為1.90%和1.41%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份已重復(fù)測(cè)定的金銀花藥材粉末1 g，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1-2。

表1 綠原酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2 木犀草苷的加樣回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,測(cè)定金銀花藥材中2種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果%

3 討論

由于綠原酸與木犀草苷極性相差較大,而且樣品中兩者的含量差別很大，故等度洗脫不能將兩者分離。經(jīng)過考察最終確定0.5%冰乙酸-乙腈作為流動(dòng)相,再進(jìn)行梯度洗脫條件的優(yōu)化,所得圖譜基線平穩(wěn),綠原酸與木犀草苷均達(dá)到較好的分離。

2010版藥典規(guī)定通過測(cè)定綠原酸和木犀草苷的含量來綜合評(píng)價(jià)金銀花的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)檢測(cè)金銀花中兩種成分的含量，在此色譜條件下兩種成分分離完全，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，快速易行，可為金銀花的質(zhì)量控制提供一定的參考。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典·一部[S].北京:中國醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)出版社,2010:205.

[2]王發(fā)國，葉華谷，馬其俠，等.金銀花及其藥理作用[J].生物學(xué)通報(bào)，2004，39（5）：17－18.

[3]張麗玲，郭 偉.HPLC法測(cè)定腦血栓丸（I號(hào)）中芍藥苷的含量[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：86-87.