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      神經(jīng)生長因子對大鼠腦缺血再灌注后Fas-L蛋白和p-PKB表達的影響

      2011-05-31 07:43:20王洪津白艷娟辛世萌
      關(guān)鍵詞:生理鹽水陽性細胞腦缺血

      王洪津,白艷娟,辛世萌

      (大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院,神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116000)

      缺血性腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病,而腦缺血再灌注損傷是治療缺血性腦血管病的一大難題。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是重要的生物活性因子之一,對神經(jīng)細胞的生長發(fā)育、分化、再生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,是參與損傷神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的重要因素,NGF可用于治療腦細胞損傷和各種神經(jīng)損傷[1]。本實驗利用經(jīng)典的MCAO模型,以免疫組化方法觀察腦缺血2 h再灌注不同時間點腦組織內(nèi)促凋亡因子Fas-L及抗凋亡因子p-PKB的表達,并觀察NGF對其表達的影響,探討NGF的神經(jīng)保護作用,為臨床應(yīng)用NGF治療腦梗塞提供理論依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 實驗動物

      健康成年SD大鼠55只(大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供),雌雄不限,體重200~250 g,清潔級,飼養(yǎng)環(huán)境溫度21°C,自由進食水。

      1.2 試劑和藥品

      p-PKB兔抗體、Fas-L兔抗體,免疫組化SABC試劑盒,DAB顯色液,注射用NGF(購于博士德試劑公司)。

      1.3 實驗方法

      1.3.1 動物分組:隨機分為假手術(shù)組(n=5)(第1組);對照組(n=30),按缺血2 h再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h再分為6組(分別為2、3、4、5、6、7組),每組5只;NGF(第8f組和8p組,分別為缺血2 h再灌注6 h和再灌注72 h注射NGF,每組5只)和生理鹽水對照組(第9f組和9p組,分別為再灌注6 h和再灌注72 h注射生理鹽水,每組5只)。

      1.3.2 腦缺血再灌注模型制備(MCAO模型):均采用線栓法行右側(cè)大腦中動脈局部腦缺血-再灌注模型。缺血2 h,再灌注時間點按分組要求。假手術(shù)組插入魚線后馬上抽出,余步驟同手術(shù)組。

      1.3.3 NGF給藥方法:第8組大鼠于再灌注后5 min肌肉注射NGF(每100 g體重NGF500BU/0.1 mL),第9組以同樣方法注入相同體積的無菌生理鹽水。

      1.3.4 神經(jīng)功能缺損評分:按Zea Long 5分制標準評分:0分,無神經(jīng)缺損癥狀;1分,不能伸展對側(cè)前爪;2分,行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向偏癱側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。0分和4分者剔除。

      1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測法:標本及切片制備:各組大鼠在各自再灌注時間點后經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定,斷頭取腦,4%多聚甲醛外固定24 h,自視交叉處開始向后做冠狀切片,石蠟包埋,連續(xù)切片4 μm,嚴格按試劑盒說明行Fas-L和p-PKB免疫組織化學(xué)染色。每張切片顯微鏡下分別隨機選取缺血區(qū)內(nèi)的4個視野,進行p-PKB陽性細胞和Fas-L陽性細胞計數(shù)。判斷標準:顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細胞數(shù),鏡下胞質(zhì)或胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,無棕黃色顆粒者為陰性結(jié)果。

      1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

      2 結(jié) 果

      2.1 神經(jīng)功能缺損評分

      假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺失,缺血再灌注組神經(jīng)功能評分見表1。其中,NGF組(8組)與生理鹽水(9組)比較,神經(jīng)功能均明顯減輕(P<0.01)。

      表1 各組神經(jīng)功能缺損評分

      2.2 Fas-L蛋白的表達

      假手術(shù)組大鼠有少量Fas-L蛋白表達(圖1),主要分布于皮質(zhì)及海馬,缺血再灌注組Fas-L蛋白表達明顯增多,光鏡下胞漿呈棕黃色,染色較深,散在分布,尤以6 h組增多明顯(圖2),24 h后逐漸下降,NGF組Fas-L蛋白表達較生理鹽水組明顯下降,染色較淡(圖3與圖4對比)。具體見表2。

      2.3 p-PKB的表達

      假手術(shù)組大鼠有少量p-PKB蛋白表達(圖5),主要分布于皮質(zhì)及海馬,缺血再灌注組p-PKB蛋白表達明顯增多,光鏡下胞漿呈棕黃色,染色較深,散在分布,尤以72 h組增多明顯(圖6), NGF組p-PKB蛋白表達較生理鹽水組明顯增加,染色較深(圖7與圖8比較)。具體見表3。

      表2 各組Fas-L蛋白表達

      表3 各組p-PKB蛋白表達

      圖1 假手術(shù)組

      圖2 6 h組

      圖3 生理鹽水組

      圖4 NGF組

      圖5 假手術(shù)組

      圖6 72 h組

      圖7 生理鹽水組

      圖8 NGF組

      3 討 論

      3.1 Fas-L凋亡基因

      Fas-L(Fas配基)是調(diào)控細胞凋亡的基因之一,屬于腫瘤壞死因子受體家族[2],是一種促凋亡蛋白。在缺血腦組織內(nèi),F(xiàn)as-L表達增多,通過以Fas/Fas-L系統(tǒng)為代表的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將凋亡信號傳遞到細胞內(nèi),促使細胞凋亡[3]。Fas-L蛋白復(fù)合三聚體具有誘導(dǎo)凋亡的能力,并通過死亡域間的相互作用促進Fas-L蛋白聚合而傳導(dǎo)死亡信號,激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,啟動靶細胞內(nèi)的凋亡程序。實驗顯示Fas-L蛋白表達增多時,凋亡明顯可見,干預(yù)治療后Fas-L蛋白表達減少,說明Fas-L與凋亡密切相關(guān)。本研究表明Fas-L蛋白在正常新生大鼠腦內(nèi)弱表達,缺氧缺血后病變部位出現(xiàn)散在分布的強陽性細胞,多是凋亡腦細胞,提示Fas-L與腦細胞凋亡有直接的關(guān)系,F(xiàn)as-L參與了腦細胞凋亡的過程。具體的說,本實驗中大白鼠缺血2 h再灌注2 h后Fas蛋白表達增加,再灌注6 h Fas蛋白表達達高峰,再灌注24 h后表達與6 h相比明顯減弱(P<0.01),與文獻報道一致,說明腦缺血再灌注后存在Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。

      3.2 p-PKB蛋白

      p-PKB(磷酸化蛋白激酶B),是一種在很多生物反應(yīng)中起重要作用的絲氨酸蛋白激酶。腦缺血時,PI3-K(3磷脂酰肌醇激酶)/PKB通路激活,可減少細胞的凋亡[4,5]。PKB為分子量大約為60 kD的蛋白激酶,是PI3-K/PKB通路中PI3-K直接的下游作用靶點,該通路激活時PI3-K可以磷酸化PKB蘇氨酸308(Thr-308)和絲氨酸473(Ser-473)位點的氨基酸殘基,從而激活PKB轉(zhuǎn)換成其活化形式(p-PKB),而p-PKB對腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有保護作用。

      3.3 NGF的神經(jīng)保護作用及機制

      NGF是神經(jīng)系統(tǒng)重要的生物活性分子之一[6]。它最初是從小鼠的頜下腺提取的,其分子量140000 kD左右,有3個亞單位組成(α、β、γ),廣泛分布于神經(jīng)元的胞體、胞質(zhì)和突起[7]。NGF作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì),有保護神經(jīng)元,對抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基和低血糖、細胞內(nèi)鈣超載及一氧化氮損傷的作用[8]。在神經(jīng)損傷后,NGF重新表達,保護受損的神經(jīng),對神經(jīng)細胞的發(fā)育、成熟、存活都有重要作用,主要可能與以下機制有關(guān)[9]:(1) NGF可提高氧自由基清除劑的活力,增加過氧化氫酶,超氧化物歧化酶,谷胱甘肽過氧化氫酶的活性,從而減少NO的產(chǎn)生量,抑制fas-L蛋白的表達,對減輕神經(jīng)元損傷有重要作用[10];(2)NGF影響細胞膜上離子泵,如Na+,K+-ATPase 的活性,穩(wěn)定細胞內(nèi)Na+/K+濃度比,拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性;(3)穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣濃度;(4)有實驗證明,NGF可以通過促進Bcl-2、HSP70的表達,抑制c-fos、c-jun、P53蛋白的表達,抑制caspase-3、ERK-1的表達[11-14],從而起到抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。

      近年的研究表明,在腦毛細血管內(nèi)皮細胞上富含一些特殊蛋白質(zhì),可轉(zhuǎn)運一些特殊蛋白質(zhì)分子。而且,血腦屏障本身還存在固有的薄弱環(huán)節(jié)。再者,腦缺血時血腦屏障可能有一定程度的破壞。故本實驗選擇肌肉注射NGF。結(jié)果表明,NGF注射組的大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低,F(xiàn)as-L蛋白表達明顯減少,p-PKB蛋白表達明顯增多,說明肌肉注射NGF有明顯的保護作用。

      參考文獻:

      [1] 路露,陳美婉,羅煥敏.神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的研究進展[J].中國老年醫(yī)學(xué)雜志,2010,30:126-131.

      [2] 張慧,尹琳,劉麗梅.尤瑞克林對大鼠腦缺血再灌注Fas-L表達的影響[J].中華全科醫(yī)學(xué),2009,7(9):907-1000.

      [3] Jin K,Graham SH,Mao X,et al. Fas(CD95) may mediate delayed cell death in hippocampal CA1 sector after global cerebral ischemia[J].J Cereb Blood flow Metab,2001,21(12):1411-1412.

      [4] Namura S,Nagata I,Kikuchi H,et al.Serine-threonine protein kinase Akt do notmediate ischemic tolerance after global ischemia in the gerbil[J].J Cerebral Blood Flow Metabiol,2006,20:I301-I305.

      [5] Yano S,Morioka M,Fukunaga K,et al.Activation of Akt/protein kinase Bcontributes to induction of ischemic tolerance in the CA1 subfield of gerbilhippocampus[J].J cereb Blood Flow Metab,2001,21:351-360.

      [6] Petruska JC,Mendell LM.The many functions of nerve growth factor: multiple actions on nociceptors[J]. Neurosci Lett,2004,361:168-171.

      [7] 張淋坤,張引成.神經(jīng)生長因子和神經(jīng)節(jié)苷脂的研究進展[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2010,13(10):89-92.

      [8] 許麗娜,藥海濱.神經(jīng)生長因子對大鼠局灶性腦缺血再灌注后P53 蛋白表達的影響[J].山西醫(yī)藥雜志,2009,38(4):326-327.

      [9] 高紅華,沈雪莉.神經(jīng)生長因子對大鼠前腦缺血再灌注后細胞凋亡及Fas 蛋白表達的影響[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué),2008,16(6):595-600.

      [10] 張志堅,何俐.血管內(nèi)皮細胞生長因子與缺血性腦血管病[J].中國臨床康復(fù),2004,l8(7):1319-1321.

      [11] 花放,方秀斌,張露,等.CRGP和NGF對大鼠全腦缺血再灌注腦組織Bcl-2 蛋白表達的影響[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2002,10:269-273.

      [12] 金大成,王鐵民,方秀斌.CRGP和NGF對短暫性全腦缺血后再灌注大鼠紋皮質(zhì)Caspase-3蛋白表達的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2004,20(3):296-300.

      [13] 鄭廣順,高亮,楊涌杰,等.CRGP和NGF對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬Ρ16蛋白表達的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2005,21:124-128.

      [14] Yang JP,Liu XF,Liu HJ,et al.Extracellular signal-regulated kinase involved in NGF/VEGF-induced neuroproprotective effect[J].Neurosci Lett,2008,434:212-217.

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