食管癌癌變過程中端粒DNA長度與細(xì)胞DNA含量的變化及意義

王大虎 左 靜 張祥宏

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理教研室，河北 石家莊 050017)

染色體末端存在一種維持染色體完整和穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)——端粒(telomere)，能防止染色體DNA降解、末端融合缺失和非正常重組〔1〕。人端粒序列為(GGATTT)n，端粒長度(terminal repeat fragment，TRF)為5～15 kb，為染色體末端提供了一個(gè)保護(hù)性“帽”，對染色體的穩(wěn)定十分重要〔2〕。每次細(xì)胞分裂，端粒會縮短55～200 bp，經(jīng)歷多次分裂短至一定界限，細(xì)胞最終凋亡或死亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，端粒長度的改變參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但在食管癌癌變過程中是否存在端粒長度的改變及其與DNA含量的關(guān)系目前報(bào)道甚少。因此，本研究收集河北省磁縣食管癌高發(fā)區(qū)人群的食管脫落細(xì)胞，定量檢測食管上皮癌變過程中細(xì)胞端粒DNA長度改變和細(xì)胞DNA含量的變化，分析其與食管上皮癌變的關(guān)系，為闡述食管上皮的癌變機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 所有標(biāo)本均來自河北省磁縣食管癌高發(fā)區(qū)現(xiàn)場，采用食管拉網(wǎng)法采集食管上皮脫落細(xì)胞，將拉網(wǎng)器網(wǎng)球上的脫落細(xì)胞部分作細(xì)胞涂片，部分收集后70%乙醇固定用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。隨機(jī)抽取100例，其中食管上皮正常組18例，輕度增生組16例，重度增生組35例，癌組31例。細(xì)胞學(xué)涂片經(jīng)常規(guī)巴氏染色，由2名富有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷〔3〕。

1.2 主要試劑 端粒肽核酸(PNA)探針試劑盒購自DAKO公司(lot 00004334和00009155)，碘化丙啶(Sigma公司)。

1.3 DNA染色 制備單細(xì)胞懸液，參照左連富的方法〔4〕，采用碘化丙啶一步插入性DNA熒光染色法，以10%雞紅細(xì)胞作內(nèi)參染色。每份樣品中加入DNA染液(每1 000 ml中含碘化丙啶 50 mg/L，RNA 酶 10 mg/L，TritonX100 1.0%)1.0 ml，4℃冰箱中染色30 min，以500目篩網(wǎng)過濾，使樣品成為合格的單細(xì)胞懸液，即可上機(jī)檢測。

1.4 原位雜交 制備單細(xì)胞懸液，取2×106個(gè)細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和背景對照組;實(shí)驗(yàn)組加入300μl含F(xiàn)ITC-(CCCTAA)3PNA探針雜交液，對照組加300μl空白雜交液，混勻后87℃避光孵育15 min變性;然后室溫下避光雜交過夜;洗滌后碘化丙啶進(jìn)行DNA染色(4℃避光孵育2 h)，400目銅網(wǎng)過濾后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測定〔5〕。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測方法 采用美國BeckmanCoulter公司Epics2XLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激發(fā)波長為 488 nm。檢測前以 flow-checkTMFluorpheres(10 μm)熒光微球(REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA 92835.)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 細(xì)胞增殖活性的分析:應(yīng)用DNA細(xì)胞周期分析軟件，計(jì)算出DNA組方圖各時(shí)相分布的百分比，以增殖指數(shù)(PI)表示細(xì)胞的增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。流式原位雜交分析:FL1通道檢測FITC熒光強(qiáng)度，F(xiàn)L3通道檢測碘化丙啶熒光強(qiáng)度，端粒熒光定量即Q-FISH值由減去背景后的G0/G1期二倍體細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度決定。Q-FISH值=實(shí)驗(yàn)樣品平均熒光強(qiáng)度－背景對照平均熒光強(qiáng)度。細(xì)胞DNA含量分析:依據(jù)二倍體參考細(xì)胞G0/1期細(xì)胞DNA含量定為2C值DNA指數(shù)(DNA index，DI)=1.0，基于標(biāo)準(zhǔn)CV值在5%，判定標(biāo)準(zhǔn)即:DNA二倍體=2C±2CV值，DNA異倍體≠2C±2CV。即:①DI=1.0±0.1(0.9～1.1)為二倍體②DI=1.0±0.15(0.85～1.15)為近二倍體③DI=2.0±2CV(1.9～2.1)為四倍體④DI＞2.1為多倍體⑤其余DI值均為非整倍體。在計(jì)算DNA異倍體時(shí)，把近二倍體、四倍體、多倍體、非整倍體劃為異倍體的范疇。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料用x±s表示，應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 食管上皮癌變過程中細(xì)胞周期分布變化 正常組、輕度增生組、重度增生組及癌組 PI值分別為(11.51±4.08)、(14.08±5.00)、(19.04±5.39)和(29.46±5.50)，隨著細(xì)胞學(xué)分級的升高，PI升高，癌組顯著高于重度增生組(P＜0.01)，重度增生組高于輕度增生組(P＜0.05);輕度增生組與正常組相比雖有升高的趨勢，但無顯著差別(P＞0.05)。相關(guān)性分析顯示，PI值與細(xì)胞學(xué)分級呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.79，P＜0.01)。2.2 食管上皮癌變過程中細(xì)胞DNA含量的變化及其與細(xì)胞學(xué)分級的關(guān)系 癌組的DI值明顯高于重度增生組、輕度增生組和正常組(P＜0.01);而正常組、輕度增生組和重度增生組的DI值雖呈上升趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);四組間異倍體率比較顯示，癌組異倍體率高于重度增生組(P＜0.01)和輕度增生組，且重度增生組高于輕度增生組(P＜0.05)，但輕度增生組與正常組相比無明顯差別(P＞0.05)。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，DI值與細(xì)胞學(xué)分級呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.60，P＜0.01)，提示隨著細(xì)胞學(xué)分級的升高，DI值增大，二倍體所占百分比明顯降低，異倍體百分比明顯升高。見表1，圖1，圖2。

2.3 食管上皮癌變過程中端粒DNA長度的變化及其與細(xì)胞學(xué)分級的關(guān)系 流式原位雜交顯示，正常組、輕度增生、重度增生和癌組中Q-FISH值分別為(50.83±8.86)、(49.51±3.16)、(36.96±8.02)和(27.81±6.59)，癌組端粒長度明顯短于重度增生組和輕度增生組(P＜0.01)，重度增生組短于輕度增生組(P＜0.01)，但輕度增生組與正常組比較無顯著性差別(P＞0.05)。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，端粒長度與細(xì)胞學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)(r=－0.79，P＜0.01)，隨著細(xì)胞學(xué)分級增高，端粒長度Q-FISH值逐漸降低。見圖1，圖3。

按照端粒長度的劃分標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，即Q-FISH值＜正常組端粒長度80%(＜0.76)為縮短，＞正常組織120%(＞1.14)為延長。100例標(biāo)本中輕度增生組9例，重度增生組22例和癌組26例端?？s短，其端粒縮短的陽性率分別為56.25%(9/16)、62.86%(22/35)和83.87%(26/31)，呈上升趨勢(P＞0.05)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2，圖1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組別的DNA含量和異倍體變化

表2 食管上皮不同組別中端粒縮短情況〔n(%)〕

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測端粒長度和DNA含量在各組中的變化

圖2 在正常食管上皮和食管癌細(xì)胞DNA倍體的不同

圖3 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測端粒長度在各組中的變化

2.4 食管上皮癌變過程中細(xì)胞端粒DNA長度與細(xì)胞DNA含量的相關(guān)性分析 FCM檢測的100例食管上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本中，隨著細(xì)胞分級逐步升高，端粒長度Q-FISH值逐步下降的同時(shí)，DI值升高，DI值與端粒長度Q-FISH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0.46，P ＜0.01)。

3 討論

原癌基因的激活、抑癌基因的突變是腫瘤形成的重要分子基礎(chǔ)。正常細(xì)胞在致癌因素作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约?xì)胞并不意味著一定能形成腫瘤，哺乳動物體內(nèi)有一套精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制控制著細(xì)胞的分裂次數(shù)，使細(xì)胞分裂達(dá)到一定程度后死亡，可見腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖的特殊能力——永生化，在腫瘤的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，端粒長度的改變參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Maruyama等〔7〕檢測了不同病變期胃黏膜的端粒長度，發(fā)現(xiàn)從正常胃黏膜到腸化、再到腺瘤的發(fā)展過程中，端粒長度逐漸縮短。Meeker應(yīng)用熒光原位雜交對114例浸潤性乳腺癌、29例原位癌和10例良性增生乳腺組織檢測證實(shí)，80.0%的浸潤性乳腺癌和78%的導(dǎo)管原位癌與自身正常對照相比，平均端粒長度有明顯縮短〔8〕。為了證實(shí)端粒與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究采用現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室相結(jié)合的方法，應(yīng)用熒光原位雜交流式定量法〔5〕(Q-Flow FISH)對食管癌高發(fā)區(qū)隨機(jī)抽取的100例食管上皮脫落細(xì)胞進(jìn)行端粒長度的檢測。結(jié)果顯示，食管癌及癌前病變細(xì)胞的平均端粒長度均顯著短于正常食管上皮細(xì)胞，其平均端粒長度隨細(xì)胞增生的程度和癌變發(fā)展階段呈漸進(jìn)性縮短，并且半數(shù)以上(56.25%輕度增生、62.86%重度增生)癌前病變端粒長度與正常組相比有顯著縮短，提示端?？s短參與了食管上皮癌變的發(fā)生。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，無論是食管癌細(xì)胞還是癌前病變細(xì)胞，端粒變化呈非均一性，既有縮短又有延長，8.57%重度增生和6.45%癌端粒長于正常平均長度，但是端?？傮w變化趨勢與食管癌及癌前病變的輕重程度相一致?？紤]可能源于幾個(gè)不同原因:①除端粒酶之外還有其他機(jī)制(如ALT)參與端粒穩(wěn)定的調(diào)節(jié);②在端粒酶或ALT起作用維持端粒長度之前，細(xì)胞增殖程度影響著總體端?？s短水平;③細(xì)胞分裂過程中端粒斷裂-融合-橋聯(lián)(breakage-fusion-bridge，BFB)造成其長短不一〔9〕;④證據(jù)顯示未經(jīng)修復(fù)的DNA氧化損傷也促進(jìn)了端粒的丟失〔10〕。

在一些腫瘤中已觀察到，染色體末端的端端融合在腫瘤形成相關(guān)基因的不穩(wěn)定性中起著重要作用，而這種融合可能起因于染色體末端長片段的丟失，如端粒的丟失〔11，12〕?；谶@種觀點(diǎn)，端粒的縮短可能引起DNA的不穩(wěn)定性，并在腫瘤的形成中起著重要作用。Ma〔13〕報(bào)道，在伴有DNA含量增高的腫瘤細(xì)胞中，存在染色體融合和(或)雙微染色體。為了證實(shí)食管上皮癌變過程中端粒長度的變化與DNA含量的關(guān)系，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析不同食管黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)DNA含量。結(jié)果顯示，隨著食管上皮從正常、輕度增生、重度增生到癌的進(jìn)展，DI值明顯增高，即DNA含量明顯增加，同時(shí)伴有異倍體數(shù)目的不斷增高，癌細(xì)胞組異倍體率達(dá)到80.65%;同時(shí)，隨著癌前病變的進(jìn)展，PI值逐步增高，處于增殖期的細(xì)胞明顯增多。對31例癌的端粒長度和DNA指數(shù)的分析顯示，總體上，在異倍體中的端粒長度明顯短于二倍體，端粒長度和DNA指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，也就是端粒越短，DNA指數(shù)越高。

本研究采用Q-Folw FISH對不同病變的食管上皮細(xì)胞進(jìn)行端粒長度檢測，此方法簡單、快速，適合體外研究和進(jìn)行大規(guī)模高發(fā)區(qū)現(xiàn)場患者的臨床研究，與傳統(tǒng)的Southern印跡測量的TRF值有良好的相關(guān)性。試驗(yàn)標(biāo)本采用的是食管拉網(wǎng)采集的脫落上皮細(xì)胞，相對減少了非上皮細(xì)胞成分的混雜，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加精確。

綜上所述，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)的方法對河北省磁縣食管癌高發(fā)區(qū)現(xiàn)場食管拉網(wǎng)獲得的食管上皮細(xì)胞進(jìn)行了端粒長度和DNA含量等的檢測和分析，結(jié)果提示在食管上皮癌變過程中存在著端粒長度及DNA含量的改變，且在癌變早期就出現(xiàn)端粒長度的縮短。考慮獲得惡性表型的食管上皮細(xì)胞端粒、DNA長度不斷縮短，同時(shí)伴有染色體DNA活躍擴(kuò)增，最終端粒維持在短而相對穩(wěn)定的狀態(tài)下，導(dǎo)致了惡性細(xì)胞永生化，引起食管癌的發(fā)生。對食管上皮細(xì)胞進(jìn)行端粒長度檢測將有助于監(jiān)測食管癌的發(fā)生，同時(shí)也為抗腫瘤治療開辟了新方向。

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