氯沙坦和氟伐他汀對殘腎大鼠氧化型低密度脂蛋白受體1表達的影響

余 毅，邱 鴻，王 琰，周麗娜

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院血液凈化科，福建福州 350025)

血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1(LOX-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種脂蛋白受體，常在內皮細胞上表達［1－2］，LOX-1 與動脈粥樣硬化有著密切的關系，而腎小球硬化與動脈粥樣硬化在病理和生化特征上十分相似［3］。殘腎大鼠和鹽負荷高血壓大鼠的腎臟可檢測到LOX-1表達增強，且LOX-1表達的量與尿蛋白顯著相關［2－3］。我們的研究表明［4］，鹽負荷高血壓大鼠主動脈氧化應激－LOX-1通路活性增強，坎地沙坦具有明顯抑制作用。沙坦類和他汀類藥物除降脂和降壓外，均有抗炎和保護腎臟的作用，它們能降低慢性腎臟病(CKD)尿蛋白，減輕腎小球硬化，延緩 CKD 的進展［5－6］，兩類藥物聯(lián)用比單獨應用作用更強［7］。他汀類藥物可明顯減少粥樣硬化的主動脈和腎動脈內膜LOX-1的表達［8］，然而，他汀類、沙坦類藥物單用及聯(lián)用對殘腎大鼠LOX-1表達的影響鮮有報道。本實驗旨在觀察氯沙坦(losartan)和氟伐他汀(fluvastatin)對大鼠殘腎模型腎臟和血管LOX-1表達的影響，探討LOX-1在CKD中的作用及他汀類和沙坦類藥物延緩CKD進展的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物分組及建立大鼠殘腎模型8周齡♂SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，分籠飼養(yǎng)于我院動物實驗科清潔級動物房。35只大鼠隨機選取28只制作大鼠殘腎模型，7只為假手術組，作為正常對照。殘腎大鼠隨機分為4組:殘腎模型組、氟伐他汀組、氯沙坦組及聯(lián)合用藥組。采用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉(50 mg·kg－1)大鼠，切開左側腹，暴露左側腎臟，分離腎動脈及其分支，結扎其中的左上支和中支并剪斷，使左腎梗死約2/3，7 d后再將大鼠右腎摘除。假手術組則只分離腎動脈及其分支，不予結扎。

1.2藥物干預大鼠殘腎模型建立后，氯沙坦組以氯沙坦30 mg·kg－1·d－1灌胃，氟伐他汀組以氟伐他汀 15 mg·kg－1·d－1灌胃，聯(lián)合用藥組以上述劑量的氟伐他汀和氯沙坦聯(lián)合灌胃。假手術組和殘腎模型組均以等量溶劑灌胃。

1.3器材及試劑PE 2400 PCR儀(美國ABI公司);氯沙坦(杭州默沙東制藥有限公司);氟伐他汀(北京諾華制藥有限公司);RNA保存液(德國QIGEN公司);山羊抗大鼠LOX-1抗體(美國Santa Cruz公司);SP免疫組織化學試劑盒(北京中山公司);TRIzol試劑(Gibco公司);Promega逆轉錄試劑盒(美國Promega公司);PCR試劑盒(日本TaKaRa公司);大鼠LOX-1、MCP-1和β-actin引物(美國Invitrogen公司)。

1.4樣品采集灌胃8周后，大鼠置于代謝籠，收集24 h尿量檢測尿蛋白定量。次日大鼠主動脈取血檢測血清尿素氮、肌酐、膽固醇和甘油三酯。取殘余腎臟置于RNA保存液中，行RT-PCR檢測。留取部分腎臟和胸主動脈置于福爾馬林液固定，石蠟包埋后切片，行PAS染色和LOX-1免疫組化。

1.5免疫組化石蠟包埋后切片，行LOX-1免疫組化檢查。切片脫蠟至水，高壓(主動脈)或0.125%胰酶修復(腎組織)，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，分別滴加一抗LOX-1(1∶200)，陰性對照以PBS代替一抗，37℃孵育。滴加生物素標記兔抗山羊IgG二抗工作液室溫孵育，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育，滴加新鮮配制的DAB顯色液，中止反應。

1.6 RT-PCR檢測腎臟LOX-1和MCP-1的表達LOX-1、MCP-1 引物序列參考相關文獻［2，9］，內參 βactin引物自行設計，各引物序列見Tab 1。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，檢測各擴增帶的灰度值，以β-actin校正作相對定量分析，結果以兩者的灰度比值表示。

1.7 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據都以±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結果

2.1生化指標與假手術組比較，殘腎模型組大鼠的尿素氮、肌酐、膽固醇、LDL和24 h尿蛋白均明顯升高(P＜0.01)。與殘腎模型組相比，氯沙坦組、氟伐他汀組及聯(lián)合用藥組的肌酐、膽固醇、LDL及24 h尿蛋白明顯下降(P＜0.05)。但氯沙坦組、氟伐他汀組和聯(lián)合用藥組間各項指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見 Tab 2。

Tab 1 Primers of LOX-1，MCP-1 and β-actin

2.2病理及免疫組化腎臟病理顯示殘腎模型組腎間質炎癥細胞浸潤明顯，腎小球系膜增生，局灶節(jié)段硬化，腎小管片狀萎縮。氟伐他汀組及氯沙坦組腎臟病變較殘腎模型組輕，而聯(lián)合用藥組比單獨用藥二組輕。大鼠腎臟LOX-1免疫組織化學顯示:與假手術組相比，殘腎模型組腎間質血管周圍和腎小管周圍LOX-1表達增多，而氯沙坦組、氟伐他汀組和聯(lián)合用藥組表達減少(Fig 1)。主動脈LOX-1免疫組織化學顯示:與假手術組相比，殘腎模型大鼠LOX-1在血管壁和血管內膜上表達明顯增多，氯沙坦組、氟伐他汀組和聯(lián)合用藥組LOX-1表達明顯減少(Fig 2)。

Tab 2 Biochemical results in each group

Fig 1 Kidney LOX-1 expression in each group(SP ×200)A:Negative control;B:Sham operated group;C，D:Remnant kidney group;E:Losartan treated group;F:Fluvastatin treated group;G:Combined-treatment group

Fig 2 Aorta LOX-1 expression in each group(SP×200)

Tab 3 LOX-1，MCP-1/β-actin mRNA ratio in kidney

2.3RT-PCR與假手術組比較，殘腎模型組LOX-1、MCP-1 mRNA 表達明顯增強(P＜0.01)，氯沙坦組、氟伐他汀組和聯(lián)合用藥組表達較殘腎模型組明顯減少(P＜0.05)。見 Tab 3，F(xiàn)ig 3，4。

3 討論

LOX-1是1997年日本學者首先發(fā)現(xiàn)的血凝素樣低密度脂蛋白受體［1］，LOX-1常表達于血管內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、血小板及腎小球系膜細胞等，病理情況下，如高血壓、高血脂和動脈粥樣硬化能使LOX-1表達上調，各種炎癥因子、血管緊張素Ⅱ都能誘導LOX-1的表達，LOX-1調節(jié)Ox-LDL多種毒性作用，誘導各種炎癥因子的表達，促進內皮功能的紊亂［2，10］。LOX-1與動脈粥樣硬化具有十分密切的聯(lián)系:①LOX-1作為Ox-LDL的主要受體，介導Ox-LDL病理作用［11］。② 在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中扮演重要角色的巨噬細胞、平滑肌細胞和內皮細胞中均檢測到LOX-1的表達［1，12］。③ 實驗動物和人類動脈粥樣硬化病變過程中可檢測到LOX-1表達增多［13］。④ LOX-1作為細胞黏附因子介導血小板和內皮細胞的結合，并誘導炎癥，促進了動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展［11］。⑤ 抗動脈粥樣硬化藥物如他汀類能抑制Ox-LDL介導的LOX-1表達［14］。

Fig 3 LOX-1 mRNA expression in kidney

Fig 4 MCP-1 mRNA expression in kidney

LOX-1與動脈粥樣硬化關系密切，而腎小球硬化與動脈粥樣硬化在病理和生化特征上十分相似，脂代謝紊亂、單核巨噬細胞浸潤及病理狀態(tài)下各種黏附分子和細胞因子的過量表達，均可誘導腎小球硬化和動脈粥樣硬化相應組織細胞中LOX-1的高表達［4］。大鼠殘腎模型類似于人類CKD中局灶節(jié)段腎小球硬化、慢性腎功能不全，本實驗中，殘腎大鼠腎臟LOX-1、MCP-1表達較對照組明顯增加，尿蛋白量增多并伴腎功能損害。免疫組化顯示腎臟和主動脈LOX-1表達增加，分析原因可能如下:① 殘腎大鼠循環(huán)和腎臟血管緊張素Ⅱ水平升高，直接刺激血管和腎臟表達 LOX-1［15］。② 血脂升高，Ox-LDL增多刺激LOX-1表達增加。③炎癥因子如MCP-1分泌增多，MCP-1誘導單核細胞黏附，促進腎組織損傷和腎間質纖維化［9］。LOX-1主要在腎間質血管和小管周圍表達，腎小球和腎小管無明顯表達，而鹽負荷伴腎臟損害的高血壓大鼠不僅腎小管間質表達LOX-1，腎小球也表達 LOX-1［2］，這可能與其系統(tǒng)血壓要明顯高于大鼠殘腎模型有關［3］。

氟伐他汀組與殘腎模型組相比，LOX-1和MCP-1表達下調，尿蛋白減少，肌酐、膽固醇和LDL明顯下降，表明氟伐他汀有降尿蛋白、降脂、抑制炎癥和延緩腎功能不全進展的作用［16］，考慮到LOX-1的表達與血脂水平、炎癥浸潤等有密切聯(lián)系［2］，氟伐他汀的抗炎和降脂作用可能與LOX-1表達減少有關。血管緊張素Ⅱ通過AT1受體介導多種病理活性，如促進血壓升高及動脈粥樣硬化形成和發(fā)展，誘導系膜增殖，導致基質生成增多和腎臟纖維化［17］。本實驗氯沙坦組血清肌酐、膽固醇、LDL和24h尿蛋白水平與殘腎模型組相比明顯下降并伴MCP-1和LOX-1表達下調，病理顯示腎臟病變明顯減輕。氯沙坦下調LOX-1的表達可能與其降壓、降脂、抗炎和拮抗血管緊張素Ⅱ等作用相關。他汀類藥物還能加強沙坦類藥物對心血管的保護作用［6，18］，本實驗中，無論是單用一種藥物，還是聯(lián)用兩種藥物，腎臟和主動脈LOX-1表達均明顯下調，推測兩藥聯(lián)用對血管和腎臟保護作用可能具有協(xié)同作用。

綜上所述，殘腎大鼠模型腎臟和主動脈LOX-1表達增強，伴有炎癥因子表達增多，LDL增高，尿蛋白增加和腎功能損害。氯沙坦和氟伐他汀能明顯下調LOX-1和MCP-1的表達，延緩腎功能損害的進展。提示LOX-1可能在CKD腎損害中發(fā)揮重要作用，沙坦類和他汀類藥物抑制LOX-1的表達，可能是其腎保護作用的部分機制，這為應用沙坦類和他汀類藥物治療CKD提供了新的靶點。

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