吡那地爾后處理在減輕家兔心肌缺血/再灌注損傷中的作用

田 濤，馬 賓，王明霞，蔡 鑫，劉進(jìn)軍，方 羚，吳士禮，高 琴，于 影，關(guān)旭東

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院心血管科、2.第一附屬醫(yī)院門診部，安徽蚌埠 233004;3.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠233030)

急性心肌梗死嚴(yán)重威脅人類健康，及早的再灌注治療，是挽救患者生命，改善預(yù)后的關(guān)鍵。但缺血心肌在恢復(fù)血供后可出現(xiàn)一系列再灌注損傷，使損傷反而加重。因此，探索如何減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雖然缺血預(yù)處理和藥物預(yù)處理能夠有效減輕I/R損傷，但由于在臨床工作中心肌缺血難以預(yù)測，所以其應(yīng)用受到一定限制。繼Zhao等［1］首次提出缺血后處理概念后，Staat等［2］首次將其應(yīng)用于臨床，效果肯定。然而，缺血后處理雖可減輕I/R損傷，但由于存在倫理及操作的制約，從而限制了其應(yīng)用［3］。為此，運(yùn)用藥物模擬缺血后處理心肌保護(hù)機(jī)制，減輕I/R損傷，可作為一種安全有效的方法。吡那地而作為一種ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP)開放劑可減輕 PC12細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞的替代模型)缺血缺氧損傷［4］及離體心肌I/R損傷。但其對(duì)在體心肌I/R損傷的影響尚未見報(bào)道。本文研究旨在利用家兔在體心肌I/R損傷模型，觀察吡那地爾后處理是否具有減輕心肌I/R損傷的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組采用左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)結(jié)扎30 min、復(fù)灌120 min的方法建立心肌I/R模型。選擇健康成年♂家兔40只(蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，每只體重2.5～3.0 kg，隨機(jī)分為5組(每組8只)，分別為①假手術(shù)組(Sham):開胸后，絲線從LAD下方穿過但不結(jié)扎;②缺血/再灌組(I/R):結(jié)扎LAD 30 min后，復(fù)灌120 min;③缺血后處理組(I-PostC):結(jié)扎LAD 30 min后，于復(fù)灌即刻，給予3輪復(fù)灌15 s/缺血15 s作為后處理;④吡那地爾后處理組(Pina):復(fù)灌即刻，通過左心室(left ventricle，LV)導(dǎo)管給予吡那地爾0.1 mg·kg－1，余同I/R組;⑤吡那地爾后處理+5-羥葵酸組(Pina+5-HD):復(fù)灌即刻，通過左心室導(dǎo)管給予吡那地爾0.1 mg·kg－1及 5-HD 5 mg·kg－1，余同 I/R 組。

1.2藥物及試劑吡那地爾(pinacidil)，5-羥葵酸(5-hydroxy decanoate，5-HD)購自 Sigma公司;伊文斯藍(lán)(Evan’s Blue)，2，3，5，-氯化三苯基四氮唑(2，3，5 triphenyl-tetrazolium chloride，TTC)購自 BIOSHARP公司;磷酸肌酸激酶(creatine kinase，CK)，丙二醛(malonaldchyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自天根生化科技公司;Bcl-2、Bax及β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3動(dòng)物模型的制備參照文獻(xiàn)建立模型［5］。經(jīng)耳緣靜脈注射烏拉坦1.2g·kg－1麻醉動(dòng)物。四肢及胸前皮下置入電極，監(jiān)測心電圖變化。氣管切開，連接呼吸機(jī)，呼吸頻率設(shè)定為40～50次/min，潮氣量為10 ml·kg－1，呼吸比為1.5∶1。右頸總動(dòng)脈插入與動(dòng)脈大小相吻合的導(dǎo)管，進(jìn)入左心室，導(dǎo)管末端通過壓力換能器連接Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)。于胸骨左緣處做一切口。逐層分離肌層見第4肋骨，剪斷后進(jìn)胸。切開心包暴露心臟，在LAD根部穿雙股4-0號(hào)絲線，結(jié)扎其中一股造成心肌梗死(結(jié)扎時(shí)用一細(xì)膠管墊于LAD與結(jié)扎線之間)，復(fù)灌時(shí)剪斷此線;另一股絲線兩端套一自制的細(xì)塑料管，在行缺血后處理時(shí)拉緊絲線造成缺血，放松則恢復(fù)灌注。建模成功標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎絲線后，心電圖胸導(dǎo)聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上抬高、T波高聳等表現(xiàn)，為缺血成功;剪斷絲線后，抬高的ST段下降，為復(fù)灌成功。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的觀察手術(shù)完成后，令家兔心臟穩(wěn)定30 min后，再結(jié)扎LAD。用Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)分別記錄缺血前、缺血30 min和復(fù)灌120 min時(shí)左心室收縮壓(left ventricular systolic ressure，LVSP)和左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)。

1.4.2血漿CK和MDA活性的測定各組于缺血前、缺血30 min和復(fù)灌120 min時(shí)，由股靜脈取血2 ml，3 000 r·min－1離心 15 min，收集上清，用 721 型分光光度計(jì)在660 nm處測定CK活性，在532 nm處測定血漿MDA含量。

1.4.3心肌缺血及梗死面積測定參照文獻(xiàn)［6］，于復(fù)灌結(jié)束后，原位結(jié)扎LAD，取出心臟，用生理鹽水漂洗心腔內(nèi)積血，由升主動(dòng)脈注入0.01 mol·L－1的Evan’s Blue1.2 ～1.4 ml，凍存30 min 后，沿垂直于心臟長軸的方向，自心尖到結(jié)扎部位，將其切成6～8片1.5 mm厚的薄片，然后置于0.03 mol·L－1的TTC中避光37℃水浴 15 min，再經(jīng)3.33 mol·L－1甲醛固定10 min后，可見梗死區(qū)(infarct size，IS)心肌呈灰白色;危險(xiǎn)區(qū)(area at risk，AAR)呈紅色;未缺血區(qū)呈藍(lán)色。數(shù)碼相機(jī)拍照并用Image J圖像分析軟件分析缺血面積(AAR占LV的比值)及梗死面積(IS占AAR的比值)。

1.4.4心肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的測定運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-RCR)檢測心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)。應(yīng)用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)引物。Bcl-2引物序列:上游5'-GCGAGAAGAGCG AGAACAACT-3'，下游 5'-CCTCCAAACAGCAGGATG AAC-3'，產(chǎn)物為454 bp。Bax引物序列:上游5'-G AGAAGGCTGAGAATGGAGATAAG-3'，下游 5'-TGA TGGAAGGGAGTGAAGAATAAC-3'，產(chǎn)物為 351 bp。β-actin引物序列:上游 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下 游 5'-CTGCAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物為205 bp。復(fù)灌結(jié)束后，取100 mg LV前壁心肌組織，迅速置于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。用TRIzol提取心肌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在Taq DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃預(yù)變性8 min，94℃變性1 min，退火(Bcl-2:53℃，Bax:52℃，β-actin:59℃)1 min，72℃ 延伸 50 s，共 32 個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10 min后，4℃終止反應(yīng)。每個(gè)標(biāo)本取5 μl產(chǎn)物在15 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠顯色。用凝膠圖像處理系統(tǒng)拍攝記錄，并使用圖像分析軟件對(duì)凝膠中每一泳帶進(jìn)行光密度掃描作半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分吸光度比值(Bcl-2/β-actin;Bax/β-actin)表示 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1心功能參數(shù)復(fù)灌120 min時(shí)，與I/R組比較，I-PostC組和Pina組動(dòng)物L(fēng)VSP升高，LVEDP降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組比較，I-PostC組和Pina組動(dòng)物 LVSP升高，LVEDP降低(P＜0.05)。比較I-PostC組與Pina組LVSP及LVEDP，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD組LVSP及LVEDP，未見差異(P＞0.05)，詳見 Tab 1。

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=8)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R;△P＜0.05 vs Pina+5-HD

Variable Group Basline Ischemia 30 min Reperfusion 120 min LVSP/kPa Sham 16.08 ±0.97 15.97 ±0.64 15.58 ±1.72 I/R 15.55 ±0.85 11.13 ±0.57* 12.58 ±0.77 I-PostC 16.12 ±1.02 11.69 ±1.33* 14.50 ±0.86#△Pina 16.18 ±1.18 11.36 ±1.20* 13.95 ±1.16#△Pina+5-HD 16.28 ±0.99 11.34 ±0.69* 12.34 ±0.84 LVEDP/kPa Sham 1.06 ±0.29 1.08 ±0.24 1.24 ±0.27 I/R 1.14 ±0.17 2.17 ±0.46* 2.18 ±0.49 I-PostC 1.05 ±0.21 2.07 ±0.47* 1.73 ±0.40#△Pina 1.22 ±0.30 2.28 ±0.53* 1.72 ±0.46#△Pina+5-HD 1.16 ±0.33 2.26 ±0.48*2.20 ±0.50

2.2血漿CK活性復(fù)灌120 min時(shí)，I-PostC組和Pina組血漿CK活性較I/R組明顯降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組相比，I-PostC組和Pina組血漿CK活性也明顯降低(P＜0.05)。比較I-PostC組與Pina組CK活性，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD組CK活性，也未見差異(P＞0.05)，詳見Tab 2。

2.3血漿MDA含量在復(fù)灌120 min時(shí)，與I/R組相比，I-PostC組和Pina組血漿MDA含量明顯降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組相比，I-PostC組和Pina組血漿MDA含量也明顯降低(P＜0.05)。比較I-PostC組與Pina組血漿MDA含量，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD血漿MDA含量，也未見差異(P＞0.05)，詳見Tab 2。

2.4心肌梗死面積比較I/R組、I-PostC組、Pina組和 Pina+5-HD組 AAR/LV，未見差異(P＞0.05)。與I/R組相比，I-PostC組和Pina組IS/AAR明顯減少(P＜0.05);與 Pina+5-HD組比較，IPostC組和Pina組IS/AAR明顯減少(P＜0.05)。比較I-PostC組與 Pina組IS/AAR，未見差異(P＞0.05);比較I/R組與Pina+5-HD組IS/AAR，也未見差異(P＞0.05)，詳見Tab 3。

2.5心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax基因的表達(dá)5組均分別擴(kuò)增出454 bp的Bcl-2目的片段、351 bp的Bax目的片段和205 bp的β-actin目的片段，見 Fig 1。與I/R組比較，I-PostC組和Pina組Bcl-2 mRNA表達(dá)增加，Bax mRNA表達(dá)降低(P＜0.05);與Pina+5-HD組比較，I-PostC組和Pina組Bcl-2 mRNA表達(dá)增加，Bax mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。比較 IPostC組與Pina組Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bax mRNA的表達(dá)，未見差異(P＞0.05);比較I/R組和Pina+5-HD組Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bax mRNA的表達(dá)，也未見差異(P＞0.05)，詳見Fig 2。

Fig 1 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of each group(RT-PCR)

Fig 2 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of each group

Tab 2 Serum CK and MDA content of each group(±s，n=8)

Tab 2 Serum CK and MDA content of each group(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R;△P＜0.05 vs Pina+5-HD

Variable Group Baseline Ischemia 30 min Reper fusion 120min CK/U·L－1 Sham 832.43 ±155.01 838.04 ±158.78 828.46 ±116.40 I/R 878.51 ±129.72 1195.66 ±223.44* 3681.38 ±598.58 I-PostC 856.12 ±116.08 1171.03 ±219.40* 2428.66 ±290.60#△Pina 787.00 ±143.37 1116.80 ±238.93* 2423.71 ±414.31#△Pina+5-HD 824.34 ±132.10 1094.07 ±203.09* 3418.50 ±507.36 MDA/μmol·L －1 Sham 2.23 ±0.18 2.25 ±0.21 2.27 ±0.23 I/R 2.21 ±0.14 2.40 ±0.18 4.96 ±0.70 I-PostC 2.22 ±0.20 2.38 ±0.24 4.03 ±0.41#△Pina 2.14 ±0.19 2.42 ±0.21 3.82 ±0.34#△Pina+5-HD 2.13 ±0.16 2.30 ±0.24 5.05 ±0.78

Tab 3 AAR/LV and IS/AAR of each group(±s，n=4)

Tab 3 AAR/LV and IS/AAR of each group(±s，n=4)

*P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs Pina+5-HD

Group AAR/LV/% IS/AAR/%I/R 46.95 ±6.18 49.95 ±7.31 I-PostC 45.45 ±5.26 26.62 ±5.60*#Pina 48.13 ±7.90 24.98 ±4.39*#Pina+5-HD 49.66 ±7.09 48.18 ±5.38

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血后處理及吡那地爾后處理均能夠明顯改善復(fù)灌后心肌的舒縮功能，降低心肌細(xì)胞CK的釋放，減輕心肌細(xì)胞的過氧化，減少心肌梗死的面積，上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)。

目前已經(jīng)證實(shí)，缺血后處理可通過開放線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP)發(fā)揮減輕 I/R損傷作用［7］。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，選用KATP激活劑吡那地爾作為后處理，通過模擬缺血后處理機(jī)制，減輕心肌I/R損傷。且這一心肌保護(hù)作用可被mitoKATP抑制劑5-HD所阻斷。但吡那地爾后處理能否通過激活心肌細(xì)胞膜KATP，發(fā)揮減輕I/R的作用，尚需進(jìn)一步證實(shí)。近期有研究報(bào)道［8］，缺血后處理心肌保護(hù)作用的發(fā)揮僅涉及mitoKATP的開放，不涉及心肌細(xì)胞膜KATP的開放。此外，吡那地爾后處理還可能通過激活血管平滑肌膜KATP，擴(kuò)張外周及冠狀動(dòng)脈，從而在復(fù)灌時(shí)發(fā)揮減輕心臟前負(fù)荷、改善心肌血供的作用［9］。

Bcl-2家族主要由Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等抗凋亡成員及 Bax、Bak、Bad等促凋亡成員組成。其中，Bcl-2和Bax是目前研究細(xì)胞凋亡的熱點(diǎn)基因，兩者比值反映了促凋亡和抗凋亡力量的對(duì)比［10］。Bax等促凋亡蛋白通過結(jié)合線粒體通透轉(zhuǎn)換孔復(fù)合體，啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑［11］。有研究表明，I/R損傷可由促凋亡蛋白Puma通過與Bcl-2及Bcl-xL結(jié)合，釋放出 Bax和 Bak，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單純?nèi)毖?復(fù)灌相比，吡那地爾后處理可上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡，減輕I/R損傷的作用。但mitoKATP的激活是否與Bcl-2及Bax mRNA的表達(dá)的變化存在具體關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。有研究表明，線粒體乙醛脫氫酶2可影響B(tài)cl-2及Bax mRNA的表達(dá)，發(fā)揮抗I/R 損傷的作用［13］。

綜上所述，吡那地爾后處理具有減輕心肌I/R損傷的作用。其機(jī)制可能是通過模擬I-PostC，開放心肌細(xì)胞mitoKATP，上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA表達(dá)的及下調(diào)Bax mRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。雖然兩種后處理方式心肌保護(hù)的效果相當(dāng)，但吡那地爾后處理更安全，適用范圍更廣。

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