全反式維A酸對子宮肌瘤發(fā)生及iNOS表達的意義

祁 歡，薛永志，洪高明

(1.包頭醫(yī)學院藥理學教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

子宮肌瘤是子宮平滑肌細胞過度增殖的性激素依賴性疾病，其生長和退化在細胞以及分子水平上的機制仍未闡明［1］。血管新生參與腫瘤及多種疾病的病理過程，而子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展也極大地依賴血管新生的作用。全反式維A酸(ATRA)作為經(jīng)典的細胞誘導分化劑，促進細胞分化，抑制腫瘤細胞誘導的血管新生［2］，可對子宮肌瘤的發(fā)病過程有影響。一氧化氮(NO)參與血管擴張、血管通透性、血小板黏附和聚集等，也參與子宮肌瘤的病理過程［4］。探討活性氧自由基NO與腫瘤的關系是近年來腫瘤病因學研究的一個熱點，而國內(nèi)外有關RA對雌、孕激素負荷法建立的大鼠子宮肌瘤中NOS的影響的報道尚不多見。本研究以雌、孕激素負荷法建立大鼠子宮肌瘤模型［5］，觀察應用ATRA前后子宮外觀及鏡下改變，以及RARα、iNOS的表達情況，深入探討ATRA在子宮肌瘤過程中的作用及其作用環(huán)節(jié)，為子宮肌瘤的藥物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑清潔級♀Wistar大鼠60只，體質量(170±10)g，動物許可證號:SCXK(蒙)2002-0001，購自內(nèi)蒙古大學實驗動物中心。苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate，E2)注射液，天津金耀氨基酸有限公司，1 g·L－1，批號:H12020529;黃體酮(progesterone，P)注射液，20 g·L－1，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號:H33020828;ATRA標準品，購自鄭州荔諾生物科技有限公司;兔抗大鼠RARα多克隆抗體、兔抗大鼠iNOS多克隆抗體，即用型SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色劑均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2主要儀器Sartorius BS210S電子天平，德國Sartorius公司;CX41RF奧林帕斯顯微鏡;形態(tài)分析系統(tǒng)，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司。

1.3動物分組及建模方法Wistar大鼠60只，經(jīng)1周的喂養(yǎng)適應后，隨機分為5組，每組12只，A組(對照組)，給予NS，劑量、時間等均與雌孕激素給藥情況相同;B組(模型組)，給予苯甲酸雌二醇注射液(0.59 mg·kg－1·d－1，wk1 ～ 12，im)、黃體酮注射液(5.9 mg·kg－1·wk－1，wk1 ～ 12，im);C 組(ATRA低劑量組)，給予雌孕激素給藥情況同B組，于第 10周起給予 ATRA(0.25 mg·d－1，d1～14，ip);D組(ATRA中劑量組)雌孕激素給藥情況同B組，于第10周起給予 ATRA(0.5 mg·d－1，d1～14，ip);E組(ATRA高劑量組)雌孕激素給藥情況同 B 組，于第10 周起 ATRA(1 mg·d－1，d1 ～14，ip)。第12周末處死所有大鼠，剪取子宮使之離體、拍照，電子分析天平稱取子宮濕重(g)，計算子宮系數(shù)(子宮重量:大鼠體質量mg·g－1)，游標卡尺測量左、右宮角長度(mm)、宮角最大直徑(mm)、宮頸長度(mm)、宮頸寬度(mm)。4%多聚甲醛溶液固定子宮標本，取子宮分角以上0.5 cm相同部位一段子宮，石蠟包埋、切片、HE染色，光學生物顯微鏡觀察平滑肌細胞的病理改變。

Tab 1 Rat uterus wet weight，uterus weight/body weight，various uterus radial line in all groups(±s，n=12)

Tab 1 Rat uterus wet weight，uterus weight/body weight，various uterus radial line in all groups(±s，n=12)

A:Control;B:Model;C:ATRA low-dose;D:ATRA mid-dose;E:ATRA high-dose.＊＊P＜0.01 vs A group;#P＜0.05 vs B group

Group Uterus wetwt/g Uterus/%of body weight Left uterus horn/mm Right uterus horn/mm Uteru s horn max dia/mm Cervix length/mm A 0.36 ±0.06 1.41 ±0.09 21.94 ±2.57 17.77 ±2.353.39 ±0.47 3.16 ±0.55 B 4.11 ±0.48＊＊ 15.39 ±0.96＊＊ 46.34 ±9.57＊＊ 39.86 ±9.21＊＊ 8.14 ±1.08＊＊ 6.24 ±0.82＊＊C 2.51 ±0.15# 8.33 ±0.85# 31.24 ±5.76# 27.43 ±5.01# 5.60 ±0.65# 3.61 ±0.72#D 3.07 ±0.65# 7.89 ±0.95# 26.55 ±4.02# 22.77 ±3.17# 5.33 ±0.58# 2.95 ±0.46#E 3.45 ±0.61# 6.12 ±0.69# 24.35 ±3.78# 21.55 ±3.52# 5.34 ±0.76# 2.94 ±0.58#

1.4免疫組化法測定RARα、iNOS的表達采用免疫組化ABC法分別測定RARα、iNOS在各組大鼠子宮肌層中的表達情況，具體步驟按試劑盒說明書方法操作，一抗稀釋倍數(shù)為1∶100。每張切片選擇染色良好區(qū)域，隨機觀察10個高倍視野。RARα、iNOS均以細胞染成棕黃色為陽性，采用形態(tài)分析系統(tǒng)統(tǒng)計每個視野中陽性細胞率，細胞陽性率以高倍鏡下每視野光密度值(OD)來表示。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，單因素方差分析進行組間比較，實驗結果用±s表示。

2 結果

2.1ATRA對各組大鼠子宮濕重、子宮系數(shù)、子宮各徑線的影響經(jīng)過12周雌孕激素負荷刺激，B組大鼠子宮濕重，子宮系數(shù)及各徑線值明顯增加(P＜0.01);而C、D、E三組大鼠子宮濕重，子宮系數(shù)及各徑線值均小于B組(P＜0.05)，而這種作用在給藥組間差異并未呈顯著性(P＞0.05)，見Tab 1。

2.2造模、給藥后各組大鼠子宮大體外觀改變，及鏡下病理組織學特征正常對照組大鼠子宮質地均勻，色澤鮮亮粉紅，未見結節(jié)、囊腫及腫脹。雌、孕激素負荷造模后，子宮色澤晦暗，明顯腫脹，甚至可見宮角局部腫塊;而ATRA給藥3組中大鼠子宮外觀都有所改變，尤其在中、高劑量組中子宮色澤明顯鮮亮，表面光滑，宮體明顯縮小(Fig 1)。

HE染色顯示，正常對照組大鼠子宮平滑肌層較薄，平滑肌細胞細長，排列整齊，呈梭形，細胞核桿狀，核仁不清，有少許嗜酸性細胞，偶見淋巴細胞。模型組大鼠子宮平滑肌出現(xiàn)多發(fā)性、局灶性增生，局部平滑肌增厚，細胞明顯粗大、增粗，肌纖維增粗，排列紊亂，有的肌層細胞縱橫交錯，呈柵欄狀改變;細胞核增大，呈短梭形或橢圓形，核仁清晰，結締組織增生明顯。ATRA治療組大鼠子宮平滑肌局灶性增生區(qū)域明顯減少，核以梭形、桿狀居多，少數(shù)呈橢圓形，核仁不清，大部分平滑肌層略厚，肌細胞排列較整齊(Fig 2)。

2.3RARα的表達情況與ATRA治療之間的關系光鏡下，大鼠子宮組織RARα的陽性細胞呈明顯的棕黃色，分布于細胞核中，表達強度不一。A組幾乎看不到表達陽性的細胞，而在其它4組中表達RARα陽性的細胞滿視野清晰可見(如Fig 3)。與A組相比，B組的RARα細胞陽性率明顯增高(P＜0.05)，與B組相比，C、D、E 3組的 RARα細胞陽性率差異則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見Tab 2。

2.4ATRA對大鼠子宮組織內(nèi)iNOS表達的影響光鏡下，大鼠子宮組織iNOS的陽性細胞呈棕黃色，弱表達于細胞質中，各組的表達強度不一，A組中幾乎看不到棕黃色染色細胞，而B組卻清晰可見，而D、E組的細胞染色狀況與對照組幾乎完全相同(如Fig 4)。形態(tài)分析系統(tǒng)統(tǒng)計每個視野中陽性細胞數(shù)的比率，與A相比，B組iNOS的陽性表達率明顯增加(P＜0.05)，與B組相比，C組陽性表達率無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而D、E組的陽性表達率則明顯降低(P＜0.05)，但二者之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Number of RARα and iNOS positive cells/high-power field in all groups(±s，n=12)

Tab 2 Number of RARα and iNOS positive cells/high-power field in all groups(±s，n=12)

*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group

Group RARα/S × OD μm2/view iNOS/S × OD μm2/view A 56.2 ±5.0 104.5 ±14.8 B 68 554.6 ±5 232.7* 4 421.8 ±466.5*C 75 545.2 ±8 227.5* 5 858.4 ±627.5 D 63 690.4 ±6 858.2* 232.6 ±36.2#E 71 564.3 ±6 352.3* 133.1 ±15.4#

Fig 1 Alteration of uterine appearance in each group Fig 2 Pathological features in uterus by HE in each group(HE strains，×200)Fig 3 Immunohistochemistry of RARα expression in rat uterus(immunohistochemistry strains，×400)Fig 4 Immunohistochemistry of iNOS expression in rat uterus(immunohistochemistry strains，×400)

3 討論

在以往的大鼠子宮肌瘤造模試驗中激素的給藥時間均大于20周，雌、孕激素的給藥量也均小于本試驗的給藥量，所以在縮小給藥時間加大給藥劑量的新情況下同樣可以成功建立子宮肌瘤模型，這一結果與Minnie Malik等的研究結果相吻合［6］。Wil Catherino等［3］通過高效液相色譜證實在與正常子宮肌層相比較時，肌瘤組織中ATRA及9-cisRA的表達下降，這一結論也更加支持我們應用ATRA來治療子宮肌瘤的設想。本次研究中發(fā)現(xiàn)雌孕激素刺激后子宮肌瘤組織中RARα和iNOS的表達明顯增加，RARα的高表達也正是應用ATRA治療的動機所在。平滑肌瘤表型的特性體現(xiàn)在胞外基質的過度分裂，有研究表明分化模式的改變在各種正常組織中，以及腫瘤組織中均被發(fā)現(xiàn)是受RA所影響［6］。試驗中發(fā)現(xiàn)平滑肌細胞的增殖被ATRA所抑制，這種抑制也呈劑量依賴性，并且肌瘤細胞對ATRA的敏感性要比肌層細胞更高［7］，表明RARα在大鼠子宮肌瘤模型中高表達，這說明這些腫瘤也都有潛在的RA治療的有效性，而我們所得出的結果也正是證實了這一推斷。

近年大量研究資料顯示多種婦科腫瘤組織中同樣存在iNOS高表達，表明NOS在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。本研究運用免疫組化技術顯示iNOS在子宮肌瘤組織中的表達高于正常子宮平滑肌組織，我們得到的結果表明iNOS的過表達與子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展過程有關，它們可能在子宮肌瘤的發(fā)病機制中起一定作用，如參與肌瘤細胞的增殖與分化，但NO和NOS究竟是通過哪條途徑促進子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展，還有待于進一步探討。在ATRA組內(nèi)，其表達的陽性率比模型組明顯降低，說明ATRA有抑制iNOS產(chǎn)生的作用，進而發(fā)揮其抗腫瘤保護子宮平滑肌的作用。而ATRA發(fā)揮作用是需要通過其受體RARα。iNOS是通過誘生催化左旋精氨酸上的胍基氮，來誘生產(chǎn)生大量NO，強烈舒張血管，增加血流量，也是維持腫瘤生長的必須條件。多項研究證實，維A酸能抑制血管生成因子活性，抑制內(nèi)皮細胞的增殖及遷移，誘導血管生成因素如內(nèi)皮抑素、血管抑素的產(chǎn)生［8］。NO又可產(chǎn)生氮氧自由基和大量亞硝酸鹽引發(fā)組織產(chǎn)生氧化/硝化應激，激活核轉錄，引發(fā)大量細胞因子產(chǎn)生［9］，這極有可能參與肌瘤的發(fā)生發(fā)展。關于ATRA如何降低iNOS陽性表達率的機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

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