產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素糞腸球菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

崔德鳳，周 波，楊桂梅，李煥榮，阮文科，汪 明，張永紅

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，北京 102206;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能夠發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸細(xì)菌的統(tǒng)稱，腸球菌(enterococcus)是乳酸菌中對(duì)營養(yǎng)要求不高、容易培養(yǎng)、分布廣泛的一類革蘭氏陽性球菌。長期以來在乳制品加工、蔬菜及肉制品的發(fā)酵工藝中廣泛應(yīng)用。腸球菌在生長繁殖過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸外，還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌活性的細(xì)菌素，在抑制多種動(dòng)物源病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要作用。Hosnia Abdel－Mohsein等從食品中分離出產(chǎn)生enterocin P細(xì)菌素的腸球菌并對(duì)其特性進(jìn)行了深入的研究［1］。分離自牛糞堆肥中的腸球菌顯示出對(duì)食物源病原微生物和腐敗菌的抑制活性［2］。從牛的胃腸道分離的希氏腸球菌對(duì)李斯特菌屬具有明顯的抑菌活性［3］。還有分離自扁角鹿、雞腸道、鴕鳥腸道、小型豬糞便等動(dòng)物源和分離自青貯飼料、乳酪發(fā)酵劑、西班牙發(fā)酵橄欖、意大利臘腸等食物源腸球菌細(xì)菌素的報(bào)道［4－11］。

細(xì)菌素的合成受到很多因素的影響，其中包括培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、收獲時(shí)間、保存條件等［12］。實(shí)驗(yàn)證明來源于鵪鶉盲腸的腸球菌產(chǎn)細(xì)菌素活性最強(qiáng)的培養(yǎng)基是ZAL［13］。研究發(fā)現(xiàn)pH和葡萄糖對(duì)Enterococcus faecium P13產(chǎn)生enterocin P的影響，細(xì)菌生長和葡萄糖消耗在pH 7.0時(shí)達(dá)到最大值，細(xì)菌素的活性呈pH依賴性，pH恒定調(diào)節(jié)為6.0時(shí)，獲得最大抑菌活性［14］。從細(xì)菌素應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)學(xué)角度出發(fā)，研究細(xì)菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，細(xì)菌素與產(chǎn)生菌的作用方式，影響細(xì)菌素產(chǎn)量的因素等具有極其重要作用。

產(chǎn)生enterocin E5細(xì)菌素的腸球菌從北京健康商品豬黑六胃腸道分離鑒定［15］，具有廣譜的抑菌活性，編碼enterocins A結(jié)構(gòu)基因。本試驗(yàn)對(duì)影響enterocin E5生產(chǎn)條件，例如培養(yǎng)基組成、pH值、培養(yǎng)溫度等進(jìn)行了全面研究。

1 材料

1.1 菌株 糞腸球菌E5由微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選的產(chǎn)細(xì)菌素菌株;指示菌大腸桿菌K88由微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基:pH 7.0～7.4。其配方為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖10 g、蔗糖5 g、醋酸鈉 15 g、枸櫞酸銨 2 g、KH2PO46 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、FeSO4·7 H2O 0.03 g、吐溫 －80 1 g、蒸餾水1 L。PYG 培養(yǎng)基:pH 6.5。其配方為大豆蛋白胨 0.5 g、酵母浸粉 0.5 g、KH2PO40.1 g、葡萄糖 0.1 g、MgSO4·7 H2O 0.02 g、MnSO4·4 H2O 0.002 g、蒸餾水 0.1 L。

2 方法

2.1 糞腸球菌E5生長曲線與抑菌活性的測定將培養(yǎng)12 h糞腸球菌E5種子液以1%的接種量接種于250 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)48 h，每隔2 h取發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌密度的測定，以未接種的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。采用UN1C0 UV－2000型分光光度計(jì)測OD600，采用EUTECH pH510型酸度計(jì)測定pH值。同時(shí)4℃ 10000 r/min離心10 min，取上清采用瓊脂擴(kuò)散法測定其抑菌圈直徑(mm)，指示菌為大腸桿菌K88。

2.2 培養(yǎng)基及其組分對(duì)enterocin E5產(chǎn)生的影響

接種糞腸球菌 E5種子液于 TSB、SM、MRS和APT四種發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD600值、pH值及抑菌效價(jià);以有機(jī)氮和無機(jī)氮(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，檸檬酸銨、硝酸鈉)代替確定培養(yǎng)基中的氮源成分，以蔗糖、乳糖、阿拉伯糖等常用碳源對(duì)確定培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行等量替換，檢測發(fā)酵液的OD600值、pH值及抑菌效價(jià);在培養(yǎng)基中添加0.1% ～1%Tween－80，以1%(V/V)種子液進(jìn)行接種，37℃需氧培養(yǎng)24 h，測定菌體密度OD600和發(fā)酵上清液的抑菌效果，確定Tween－80的用量。

2.3 培養(yǎng)基起始pH值的確定 用3 mol/L的HCl或3 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的pH值至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，接種腸球菌E5，37℃培養(yǎng)48 h，測定菌體生長密度OD600與細(xì)菌素抑菌活力。

2.4 最適培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式的確定 將接種糞腸球菌 E5 的 MRS 培養(yǎng)基分別在 20、25、30、37、42℃培養(yǎng)24 h，以最適培養(yǎng)溫度選擇振蕩和靜止的方式培養(yǎng)24 h，測定細(xì)菌生長密度OD600和抑菌效果。

2.5 接種細(xì)菌種齡、接種量的確定 分別將不同種齡(6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)的糞腸球菌E5種子液按1%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，測定菌體密度OD600與抑菌效果。

取最適種齡糞腸球菌E5菌液以1.0% ～10%接種量進(jìn)行接種，37℃培養(yǎng)24 h，測定菌體密度OD600和上清液的抑菌效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 糞腸球菌E5生長曲線與抑菌活性的測定結(jié)果如圖1所示。糞腸球菌E5在培養(yǎng)2、3 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，細(xì)菌濃度呈指數(shù)式的增長，16～18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌濃度增長速度緩慢，發(fā)酵2 h后pH值顯著下降，發(fā)酵22 h后pH值趨于穩(wěn)定，從整個(gè)發(fā)酵過程可以看出菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，最終pH值為4.5左右。糞腸球菌E5的抑菌活性曲線與細(xì)菌生長動(dòng)力學(xué)走勢基本相似。細(xì)菌培養(yǎng)2 h可以檢測到enterocin E5細(xì)菌素，抑菌活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況類似于菌濃度OD600值的變化，在對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌素開始產(chǎn)生，18 h進(jìn)入穩(wěn)定期后細(xì)菌素產(chǎn)量緩慢增加，未觀察到細(xì)菌素產(chǎn)量的減少趨勢。通常認(rèn)為細(xì)菌素的產(chǎn)生與生長相關(guān)聯(lián)，有的細(xì)菌素在細(xì)胞開始生長時(shí)即可產(chǎn)生，而有的細(xì)菌素則在對(duì)數(shù)生長后期或穩(wěn)定期產(chǎn)生，在生長到一定時(shí)間后抑菌活性降低，可能是由于細(xì)菌素吸附到產(chǎn)生菌細(xì)胞表面導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)菌素活性的下降，也可能是細(xì)菌素發(fā)生降解而失活［16］。

圖1 不同時(shí)間下菌體密度與enterocin E5抑菌效果

3.2 細(xì)菌素高產(chǎn)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化 糞腸球菌E5在TSB、SM、MRS和APT四種培養(yǎng)基上均能夠生長，APT最有利于腸球菌株的菌體生長，SM產(chǎn)生的菌體濃度最低，細(xì)菌素抑菌活性最小，MRS細(xì)菌素產(chǎn)量最大，其次依次為TSB、APT和SM，因此選取MRS作為糞腸球菌E5生產(chǎn)細(xì)菌素用培養(yǎng)基。

3.2.1 碳源對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 碳源:分別采用乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖取代MRS中的葡萄糖成分，以1%(m/V)的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始 pH 6.5、37℃培養(yǎng)48 h，測定菌體生長與抑菌圈直徑，結(jié)果如表1所示。

表1 碳源成分對(duì)enterocin E5產(chǎn)量的影響

可以看出除木糖細(xì)菌濃度較低外(因糞腸球菌E5不發(fā)酵木糖)，其他幾種糖均能促進(jìn)細(xì)菌生長及細(xì)菌素的產(chǎn)生，培養(yǎng)液pH變化明顯，呈弱酸性，葡萄糖和蔗糖對(duì)細(xì)菌素的形成作用最明顯。

3.2.2 氮源對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 分別用大豆蛋白胨、蛋白胨、檸檬酸銨和硝酸鈉替代MRS中的胰蛋白胨，按1%(m/V)的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始pH 6.5、37℃培養(yǎng)48 h，測定菌體生長與抑菌圈直徑，結(jié)果如表2所示。

表2 氮源成分對(duì)enterocin E5產(chǎn)量的影響

可以看出，胰蛋白胨最有利于細(xì)菌的生長及細(xì)菌素的產(chǎn)生，添加蛋白胨、大豆蛋白胨細(xì)菌素產(chǎn)量較低;無機(jī)氮源不能滿足細(xì)菌細(xì)胞生長需要與細(xì)菌素的生成，培養(yǎng)液pH值基本無變化。有機(jī)氮源的種類對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生有較大影響，不同來源的菌株對(duì)氮源的需要有所不同，細(xì)菌素產(chǎn)量也不盡相同。

3.2.3 Tween－80添加量對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響Tween－80是一種表面活性劑，可以促進(jìn)細(xì)菌素的產(chǎn)生和抑菌活性的增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)Tween－80的添加量為0.1%時(shí)，抑菌圈直徑為1.8 cm，比不添加Tween－80的對(duì)照組(抑菌圈直徑1.62 cm)抑菌活性提高了10%。

3.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 結(jié)果如圖2所示，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量有較大影響，在初始pH 6.5時(shí)細(xì)菌素產(chǎn)量最大，偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生。細(xì)胞生長變化較小，在pH 6.5時(shí)OD600達(dá)到最大值，這也說明細(xì)菌素的產(chǎn)生與細(xì)胞生長呈正相關(guān)。

圖2 初始pH值對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的影晌

3.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 分別將接種糞腸球菌E5的MRS培養(yǎng)基置于不同的溫度(20、25、30、37、42℃)培養(yǎng)24 h，測定菌體生長密度與抑菌圈直徑(表3)。細(xì)菌最低生長溫度為20℃，最高生長溫度42℃，隨著溫度的升高，細(xì)菌密度不斷增加，在37℃達(dá)到最大值，細(xì)菌生長最好，獲得最大細(xì)菌素活性單位。高于37℃，細(xì)菌生長密度明顯降低，這與資料報(bào)道的某些細(xì)菌素在低于最適培養(yǎng)溫度條件下有較高細(xì)菌素產(chǎn)量的結(jié)論不一致，說明細(xì)菌素的產(chǎn)生是一種復(fù)雜生理代謝過程，與多種因素有關(guān)。糞腸球菌E5在振蕩和靜止情況下都能生長，2種培養(yǎng)方式的菌體密度和抑菌效果差異不顯著。

表3 培養(yǎng)溫度對(duì)enterocin E5產(chǎn)量的影響

3.5 接種種齡、接種量對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 不同種齡對(duì)菌體密度和細(xì)菌素抑菌效果的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示:種齡10～14 h之間細(xì)菌素產(chǎn)量基本一致，種齡14 h菌體密度最高，抑菌效果最明顯，16 h后菌體密度和發(fā)酵上清液的抑菌效果有降低的趨勢。

最佳接種量的確定:隨著接種量的改變細(xì)菌素的抑菌效果變化很大，接種量2% ～10%時(shí)菌體密度基本沒有太大變化，0.5%接種量細(xì)菌生長較慢，接種量2%時(shí)抑菌效果最好，可能2%接種量有利于細(xì)菌的快速生長和細(xì)菌素的分泌和積累。

4 討論

細(xì)菌產(chǎn)細(xì)菌素一方面由內(nèi)在的遺傳特性所決定，另一方面還會(huì)受到生長環(huán)境條件的限制，例如營養(yǎng)(包括碳源和氮源)［17］、溫度、初始 pH、生長刺激因子、培養(yǎng)方式以及其他代謝物都會(huì)影響細(xì)菌素的產(chǎn)量與活性。本實(shí)驗(yàn)采用幾種常用乳酸菌培養(yǎng)基檢測細(xì)菌素活性，發(fā)現(xiàn)APT最有利于糞腸球菌E5株菌體的生長，但是MRS最適合細(xì)菌素的產(chǎn)生與積累，因此選取MRS作為糞腸球菌E5細(xì)菌素生產(chǎn)用培養(yǎng)基。

乳酸菌在細(xì)菌生長的過程中產(chǎn)生細(xì)菌素，培養(yǎng)條件刺激細(xì)菌細(xì)胞生長和細(xì)菌素的合成［18－19］，然而提高生長率和細(xì)菌菌體濃度對(duì)獲得滿意的細(xì)菌素水平并不是必需的，環(huán)境條件完全可以影響特定細(xì)菌素的產(chǎn)生。即使細(xì)菌素產(chǎn)生菌生長很好，每個(gè)細(xì)胞合成多少細(xì)菌素，怎樣產(chǎn)生的都不能確定。在這種情況下，培養(yǎng)基的成分、最適pH、培養(yǎng)溫度等條件尤為重要。

為了探討細(xì)菌主要營養(yǎng)素碳源和氮源對(duì)菌體生長、菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響，按MRS培養(yǎng)基的碳源比例分別用蔗糖、乳糖、麥芽糖等常用碳源對(duì)原培養(yǎng)基中的葡萄糖作了等量替換。實(shí)驗(yàn)證明，糞腸球菌E5菌株的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。此結(jié)果與大多數(shù)的細(xì)菌素產(chǎn)生菌的碳源需求相似，可能是因?yàn)槿樗峋哂幸粋€(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和蔗糖的運(yùn)轉(zhuǎn)與伴隨的磷酸化代謝途徑。實(shí)驗(yàn)分別以15 g的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源代替MRS培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母浸粉總量，結(jié)果表明胰蛋白胨和酵母浸粉最有利于細(xì)菌素的生成。研究表明胰蛋白胨和酵母浸粉對(duì)乳酸乳球菌產(chǎn)生nisin有很大影響，兩種成分都能增加nisin的產(chǎn)量，然而高濃度的胰蛋白胨會(huì)使nisin產(chǎn)量減少［20］。研究發(fā)現(xiàn)增加培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的含量可以使微球菌GO5產(chǎn)生的micrococcin GO5產(chǎn)量有很大提高，培養(yǎng)起始pH為7.0～9.0，最適溫度為37℃，在 MRS組成中，乳糖和蔗糖更利于 micrococcin GO5產(chǎn)生［21］。有機(jī)氮源的種類對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)量也有影響，這可能與細(xì)菌素合成機(jī)制有關(guān)，某些氮源物質(zhì)成分誘導(dǎo)了細(xì)菌素基因的啟動(dòng)［22］。

Tween－80是一種表面活性劑，作為一種乳化劑，能夠降低細(xì)菌與玻璃器材之間的表面張力，改善細(xì)菌素產(chǎn)生菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)菌素的形成和活力的增強(qiáng)，但Tween－80過量會(huì)影響硫酸銨反應(yīng)，形成沉淀，使純化難度加大［12］。本實(shí)驗(yàn)比較了添加 Tween－80對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的影響，確定0.1%的Tween－80有利于細(xì)菌素的形成。

各種細(xì)菌素產(chǎn)生的最適溫度各不相同，這與細(xì)菌的種類與不同的來源有關(guān)。乳酸鏈球菌產(chǎn)生Nisin的 最 適 溫 度 為 30℃［20］，而 擴(kuò) 展 短 桿 菌ATCC9175在25℃時(shí)類細(xì)菌素的產(chǎn)量最高，37℃細(xì)菌素產(chǎn)量不明顯［22］。乳酸菌 CCUG42687合成Sakacin P最適溫度為20℃，在25℃ ～30℃細(xì)胞濃度低時(shí)，Sakacin P停止形成，培養(yǎng)溫度 20℃時(shí)Sakacin P的產(chǎn)量是30℃時(shí)的7倍，葡萄糖耗盡時(shí)，Sakacin P濃度非常低，酵母粉濃度增加，細(xì)菌細(xì)胞增長率增加，伴隨Sakacin P產(chǎn)量增加，胰蛋白胨的濃度對(duì)Sakacin P也有正向影響［23］。而腸球菌RZS C5產(chǎn)細(xì)菌素的溫度必須控制在35℃。本實(shí)驗(yàn)中的糞腸球菌E5產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素的最適溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的影響差異不顯著。糞腸球菌E5在細(xì)菌生長穩(wěn)定期后獲得最大抑菌活性細(xì)菌素，與大多數(shù)細(xì)菌素產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)相似。

乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素受許多因素制約，培養(yǎng)基起始pH值是影響細(xì)菌素合成的重要因素之一。研究顯示培養(yǎng)基起始pH值能夠影響乳鏈球菌生長和nicin的生物合成，pH值4.0～4.5時(shí)細(xì)菌生長較差，pH值4.0時(shí)沒有觀察到nicin生物合成，培養(yǎng)基最適pH值為4.6～6.6。細(xì)菌素Nisin在pH值偏酸性時(shí)，抑菌活性強(qiáng);在pH值偏中性時(shí)，抑菌效果顯著下降［24］。不同的細(xì)菌素適用的pH范圍不同，大多數(shù)在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，作用效果也較好。但很多細(xì)菌素在中性或堿性條件下，抑菌活性減弱或喪失，如 PediocniAcH、PediocinA、PediocinPA.1、Uctaein、Lactaein27、Acidolin、Nisin 和 Diplococcin 具有相似的特征，此現(xiàn)象可能是由于細(xì)菌素分子在堿性條件下降解造成的。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基在初始pH 6.5時(shí)細(xì)菌素產(chǎn)量最大，偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生。這一結(jié)果與細(xì)菌素的pH值生物學(xué)耐受性的特性相符［25］。

5 結(jié)論

本文首次報(bào)道從北京優(yōu)良地方品種黑六豬胃腸道分離產(chǎn)enterocin E5糞腸球菌，并確定了最適培養(yǎng)條件為MRS培養(yǎng)基，起始pH值6.5、培養(yǎng)溫度37℃，接種量2%、種齡14 h，發(fā)酵時(shí)間16 h，最佳培養(yǎng)基組分氮源為1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源為1%葡萄糖、0.5%蔗糖，0.1%Tween－80有利于enterocin E5的產(chǎn)生。上述結(jié)論為enterocin E5作為抗菌制劑的研制奠定了理論基礎(chǔ)。

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