細(xì)菌一種“新的分泌機(jī)制”初探

李澤鴻，彭其勝

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062)

革蘭氏陰性細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)四種蛋白質(zhì)分泌途徑，稱為 I、II、III、IV 型分泌機(jī)制［1］。II和 IV 型是Sec系統(tǒng)依賴途徑(Sec基因編碼一些分泌途徑必需的Sec蛋白質(zhì)，這些分泌途徑被稱為Sec依賴的分泌途徑)。蛋白質(zhì)被這兩種分泌途徑運(yùn)輸經(jīng)過細(xì)胞膜前，有一個獨立的跨過內(nèi)膜的步驟。II型和IV型分泌蛋白質(zhì)的共同之處在于外排到周質(zhì)時蛋白的氨基端上存在一個疏水信號序列。信號序列幫助蛋白質(zhì)分泌，當(dāng)分泌蛋白到達(dá)周質(zhì)時會被信號肽酶剪切掉［2］。I型是 Sec非依賴途徑。與II型和IV型分泌途徑相比較，I型和III型分泌不依賴于Sec系統(tǒng)，所以不需要分泌蛋白的氨基端加工。I型和III型途徑的蛋白質(zhì)分泌是一個連續(xù)的過程，不存在明顯的周質(zhì)中間體［3－4］。

重組蛋白在大腸桿菌胞周質(zhì)中分泌表達(dá)應(yīng)屬于II型分泌機(jī)制［2］，在重組蛋白的氨基端通常融合一段信號肽基因，當(dāng)翻譯完成后，這條信號肽就會被大腸桿菌胞質(zhì)中的信號肽酶切除，這是一條傳統(tǒng)的分子生物學(xué)基本原理。但是，本文在構(gòu)建一種重組毒素DAB389(Gly4Ser)2－αMSH時，發(fā)現(xiàn)另一種原核胞周質(zhì)分泌表達(dá)機(jī)制:在該重組蛋白的前面沒有信號肽基因，卻能在胞周質(zhì)中分泌表達(dá)。為此將這種現(xiàn)象提出并做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 質(zhì)粒 pET28a(+)、pET20b(+)、Rosettablue(DE3)、BL21(DE3)pLysS購置于Novagen公司;pMD18T載體試劑盒購于大連寶生物公司;pET28a/DAB389(Gly4Ser)2－EGF質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所張國利博士惠贈;大腸桿菌JM105由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司。誘導(dǎo)劑IPTG購自Merck公司，蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn)購自上海生物化學(xué)研究所。Cu Chelating Sepharose Fast Flow親和層析設(shè)備及介質(zhì)購自瑞典Pharmacia Biotech公司。抗白喉毒素陽性血清為本實驗室保存，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠抗馬IgG為Sigma產(chǎn)品;PCR引物、寡核苷核片段的合成及DNA測序由大連TaKaRa公司承擔(dān)。

1.1.3 PCR引物及寡核苷酸片段的設(shè)計 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH上、下游引物分別為:

1.2 方法

1.2.1 DAB389(Gly4Ser)2－ αMSH 基因片段的PCR擴(kuò)增 94℃預(yù)變性4 min，擴(kuò)增參數(shù):94℃ 40 s，50℃ 50 s，72℃ 60 s，7 個循環(huán)，94℃ 40 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s，30 個循環(huán);72℃延伸 10 min。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物純化后，置于 pMD18T載體，構(gòu)建 pMD18T－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行 Nco I和EcoR I雙酶切，得目的基因 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH，與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a(+)載體連接，得到融合蛋白表達(dá)載體 pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH，篩選陽性克隆后測序鑒定，對pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH 進(jìn)行 Nco I和EcoR I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的載體 pET20b(+)連接，得融合蛋白表達(dá)載體pET20b－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH，篩選陽性克隆后測序鑒定。

1.2.3 表達(dá)蛋白及 SDS－PAGE分析 分別將pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH、pET20b－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH轉(zhuǎn)化Rosettablue(DE3)，用終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃，3 h誘導(dǎo)表達(dá)。收集表達(dá)宿主菌，用10倍體積的蔗糖溶液(20%蔗糖，20 mmol/L Tris－ Cl，2 mmol/L EDTA)懸浮菌體，4℃放置10 min，離心收集菌體，用4℃ 重蒸水懸浮菌體，4℃放置10 min，離心，取上清液SDSPAGE分析蛋白表達(dá)形式，然后收集表達(dá)宿主菌的原生質(zhì)體，超聲波裂解后SDS－PAGE分析蛋白表達(dá)形式。

1.2.5 Cu Chelating Sepharose Fast Flow 親和層析純化目的蛋白 色譜柱填裝完成后，用起始緩沖液A平衡層析柱10～15個柱床，上樣，用起始緩沖液A洗脫流穿峰至基線平穩(wěn)，以A(20 mmol/L Tris－Cl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.5)→B(20 mmol/L Tris －Cl，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑液，pH 7.5)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為3 mL/min，時間90 min。收集各組分峰成分進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1.2.6 DAB389(Gly4Ser)2－ αMSH 中的信號肽分析 將DAB389(Gly4Ser)2－αMSH一級結(jié)構(gòu)輸入Technical University of Denmark 的 SignalP 3.0 Server，進(jìn)行信號肽序列分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因DAB389(Gly4Ser)2－αMSH片段的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示:DAB389(Gly4Ser)2－αMSH基因片段為1278 bp，與預(yù)期的大小相符(圖1)。

圖1 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 免疫毒素 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH的兩種表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 pET28a(+)和pET20b(+)同為Novagen的pET表達(dá)載體系列，后者帶有pelB leader信號肽，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入載體pET28a(+)后，得 pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH，經(jīng)Nco I和EcoR I雙酶切后，插入相同酶切的pET20b(+)即可得到 pET20b－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH表達(dá)載體。DNA測序證實兩種表達(dá)載體插入的目的基因無堿基突變和讀碼框轉(zhuǎn)移。

2.3 免疫毒素 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH的表達(dá)與分析 兩種表達(dá)載體pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH和pET20b－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH分別轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)后，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，其中pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE分析(圖2)，在Mr 46 000有一條明顯的條帶，與預(yù)期值相符;表達(dá)宿主菌經(jīng)過糖－水滲透溶脹后，取其上清進(jìn)行SDS－PAGE。結(jié)果表明，免疫毒素DAB389(Gly4Ser)2－αMSH以分泌細(xì)菌周質(zhì)形式表達(dá);pET20b－DT389－MSH表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果表明，DAB389(Gly4Ser)2－αMSH不能表達(dá)。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析結(jié)果

2.4 Western印跡分析 pET28a－DAB389(Gly4Ser)2－αMSH在Rosetta(DE3)中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western印跡分析檢測，在對應(yīng)于DAB389(Gly4Ser)2－αMSH處有明顯的蛋白雜交帶(圖3)，說明產(chǎn)物為特異性蛋白。

圖3 Western－Blot鑒定結(jié)果

2.5 Cu Chelating Sepharose Fast Flow純化DAB389(Gly4Ser)2－αMSH 表達(dá)蛋白經(jīng)55%硫酸銨鹽析后，脫鹽，然后經(jīng)Cu Chelating Sepharose Fast Flow層析純化，分離的目的蛋白純度達(dá)到90.53%(圖4)。

心理學(xué)家在研究創(chuàng)新思維的培養(yǎng)問題時指出∶“學(xué)生的學(xué)習(xí)動機(jī)和求知欲，不會自然涌現(xiàn)，它取決于教師所創(chuàng)設(shè)的教學(xué)情況?！彼?，教師必須經(jīng)常地、有意識地為學(xué)生精心創(chuàng)設(shè)各種情景。

圖4 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH蛋白經(jīng)Cu Chelating Sepharose Fast Flow純化的結(jié)果

2.6 DAB389(Gly4Ser)2－ αMSH 性質(zhì)分析 通過SignalP 3.0 Server(Technical University of Denmark)分析DAB389(Gly4Ser)2－αMSH中的信號肽存在情況(圖5、表1)，重組蛋白氨基端前70個氨基酸中不存在信號肽。

圖5 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH中信號肽的預(yù)測分析結(jié)果

表1 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH中信號肽的預(yù)測結(jié)果Sequence length=70

通過另一種信號肽軟件SignalP－HMM分析，結(jié)果也同樣顯示在DAB389(Gly4Ser)2－αMSH的氨基端不存在信號肽。

3 討論

在本實驗中，Rosetta(DE3)表達(dá)宿主菌經(jīng)過糖－水滲透溶脹后，得原生質(zhì)體［5］。SDS－PAGE分析其周質(zhì)成分時，發(fā)現(xiàn) DAB389(Gly4Ser)2－αMSH分泌在細(xì)菌的周質(zhì)腔內(nèi)，Western分析其表達(dá)蛋白也具有特異性，確系本文構(gòu)建的重組蛋白。由于用于表達(dá)的質(zhì)粒是pET28a，該質(zhì)粒是一種胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)基因插入在質(zhì)粒的Nco I和EcoR I之間，在起始密碼子(ATG)處根本不存在信號肽序列，而且通過Signal neural networks軟件(NN)分析重組蛋白的特性，發(fā)現(xiàn) DAB389(Gly4Ser)2－αMSH的氨基端也不存在信號肽序列。將這種現(xiàn)象與革蘭氏陰性細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)的四種蛋白質(zhì)分泌表達(dá)機(jī)制相比較，發(fā)現(xiàn)DAB389(Gly4Ser)2－αMSH分泌表達(dá)雖然與II、IV型分泌機(jī)制類似［4］，都是將蛋白分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔中，但是由于 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH的氨基端不含有信號肽，因此這種分泌機(jī)制不應(yīng)屬于II、IV型;I型和III型途徑的蛋白質(zhì)分泌是一個連續(xù)的過程，不存在明顯的周質(zhì)中間體，不依賴于Sec系統(tǒng)，因此這種分泌機(jī)制也不應(yīng)屬于 I、III型［2－3］，因此本文推測在革蘭氏陰性細(xì)菌中可能還存在另一種蛋白質(zhì)分泌機(jī)制。

白喉棒狀桿菌毒素(Diphtheria toxin，DT)系白喉桿菌分泌胞外的蛋白質(zhì)，由β－棒狀桿菌噬菌體所攜帶的tox基因整合于染色體而編碼的?；蛉L為2 200 bp，其中301～375 bp為信號肽基因，376～1980 bp編碼白喉毒素，從其基因特點和編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)來看，它屬于I型分泌系統(tǒng)，蛋白完成轉(zhuǎn)膜后，信號肽酶會將其自動切除［6］。本文構(gòu)建的免疫毒素DAB389(Gly4Ser)2－αMSH中的毒素部分DAB389為DT中除去受體結(jié)合區(qū)后所剩的成熟肽部分，不含信號肽。本實驗表明，在免疫毒素前面置入功能較強(qiáng)的信號肽pelB后，在大腸桿菌中反而不表達(dá) DAB389(Gly4Ser)2－αMSH，對這種現(xiàn)象學(xué)者們早有解釋:并不是在重組蛋白前加入信號肽就能導(dǎo)致其分泌表達(dá)，它只是一個必要條件，要分泌表達(dá)還與其他因素有關(guān)。例如，氨基端前20～30個氨基酸的疏水性、正電荷的分布及宿主菌的性質(zhì)等影響蛋白的分泌表達(dá)［7－8］。但對于 DAB389(Gly4Ser)2－αMSH在胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒中分泌表達(dá)這種現(xiàn)象至今尚無人涉及，作者認(rèn)為:可能在DAB389(Gly4Ser)2－αMSH的氨基端含有類似信號肽功能的序列，在蛋白表達(dá)中起信號肽的作用，引導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)菌周質(zhì)腔內(nèi);而且，這條類似信號肽的序列在轉(zhuǎn)膜完成后不被切除，因為從目前銅離子親和層析純化結(jié)果來看，DAB389(Gly4Ser)2－αMSH前引入的His·Tag序列并未被切除，如果被切除，純化的效果不會如此明顯。

總之，無論上述解釋和推測正確與否，但是本實驗發(fā)現(xiàn)的這種現(xiàn)象很有意義，以期引起學(xué)者們的思考。

參教文獻(xiàn):

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