懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用和展望

張 韌，秦玉明，陳文慶，劉華杰，王建超，高 飛

(1.北京清大天一科技有限公司，北京 102200;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

目前，國(guó)內(nèi)生物疫苗生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的抗原時(shí)，普遍采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)工藝，該方法存在細(xì)胞密度低、病毒產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺點(diǎn)。誕生于20世紀(jì)60年代的懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，能夠獲得大量的病毒產(chǎn)物和高質(zhì)量的疫苗產(chǎn)品，在國(guó)外疫苗生產(chǎn)中普遍應(yīng)用。懸浮培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器中、人工條件下高密度大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生物制品生產(chǎn)的技術(shù)，根據(jù)細(xì)胞是否貼壁，分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和貼壁細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)技術(shù)最大優(yōu)勢(shì)是通過(guò)更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時(shí)能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用歷史和現(xiàn)狀

1962年，Capstick等對(duì)BHK21細(xì)胞馴化實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)［1］，并用于獸用疫苗生產(chǎn)［2］。1967 年，Van Wezel開發(fā)了微載體［3］并實(shí)現(xiàn)在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)與微載體培養(yǎng)標(biāo)志著細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的開始，細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗也成為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)生物制品的第一次浪潮。20世紀(jì)80年代后，CHO細(xì)胞實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，治療性抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)著生物反應(yīng)器在生物制藥行業(yè)中的應(yīng)用，到20世紀(jì)末已進(jìn)入萬(wàn)升級(jí)規(guī)模［4］。2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基等技術(shù)的發(fā)展，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設(shè)備的生物反應(yīng)器規(guī)模也趨向大型化和簡(jiǎn)單化?，F(xiàn)在，全球10000 L及以上體積的反應(yīng)器達(dá)一百多臺(tái)，最大已達(dá)25000 L，且?guī)缀醵际强梢苑糯蟮臋C(jī)械攪拌式反應(yīng)器，主要為Genetech、Amgen、Boehringer Ingelheim 和 Lonza 等公司所擁有［5］。當(dāng)前生物制藥的主流技術(shù)是在大型機(jī)械攪拌式反應(yīng)器中，用無(wú)血清培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)［6］。

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域在快速發(fā)展。2007年全球銷售額最高的6大類生物技術(shù)藥物中，有5類是經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的［7］。現(xiàn)代基因工程技術(shù)及個(gè)性化培養(yǎng)基技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)制藥的快速進(jìn)展，例如開發(fā)出MDCK細(xì)胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的雞胚生產(chǎn)，10 L密度為106個(gè)/mL的細(xì)胞產(chǎn)能相當(dāng)于10000只雞胚的產(chǎn)量［8］。國(guó)際知名廠家紛紛進(jìn)行細(xì)胞改造篩選，發(fā)展自己的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)進(jìn)行流感疫苗的生產(chǎn)，包括Baxter公司的Vero細(xì)胞平臺(tái)、Crucell公司和賽諾菲巴斯德的PER－C6細(xì)胞平臺(tái)、諾華公司的MDCK細(xì)胞平臺(tái)等［9］。

縱觀國(guó)內(nèi)，人用和獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)已超過(guò)110家，應(yīng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的僅4家。生產(chǎn)人用疫苗的企業(yè)有3家，規(guī)模是數(shù)十臺(tái)14～30 L進(jìn)口反應(yīng)器;一般獸用疫苗企業(yè)采用國(guó)內(nèi)自主開發(fā)的650 L和1200 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗［10］。在治療性抗體生產(chǎn)方面，有2家企業(yè)采用進(jìn)口1000～3000 L生物反應(yīng)器生產(chǎn)，但與國(guó)外萬(wàn)升級(jí)規(guī)模相比還有較大的差距。

我國(guó)“七五”至“八五”攻關(guān)期間立項(xiàng)研發(fā)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器，但由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、壁壘大，研發(fā)單位在未掌握核心技術(shù)的情況下，僅憑模仿很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，國(guó)產(chǎn)細(xì)胞生物反應(yīng)器在2008年以前幾乎是空白;由于細(xì)胞株等上游配套技術(shù)落后、缺乏個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基支持以及生化工程研究等原因，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一直難以突破技術(shù)瓶頸［11］?！吨袊?guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告(2005)》指出:自主綜合支撐技術(shù)是大規(guī)模懸浮培養(yǎng)技術(shù)在我國(guó)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化最難以跨越的技術(shù)“門檻”。

2 懸浮培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵技術(shù)

生物制品生產(chǎn)過(guò)程研發(fā)的兩個(gè)主要目的是提高產(chǎn)率、保證產(chǎn)物的質(zhì)量和過(guò)程工藝設(shè)計(jì)的一致性，前者直接關(guān)系到商業(yè)化生產(chǎn)的可行性，后者則關(guān)系到藥物的安全和有效性。對(duì)應(yīng)懸浮培養(yǎng)技術(shù)主要包括高表達(dá)細(xì)胞株的獲得、個(gè)性化培養(yǎng)基的研發(fā)、動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器及配套設(shè)施的完善及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等四個(gè)方面。

2.1 細(xì)胞與毒株的馴化與保藏 為提高生物制品的產(chǎn)率和安全有效性，在生物反應(yīng)器中繁殖的病毒與細(xì)胞需要進(jìn)行相互適應(yīng)選擇，針對(duì)不同的毒株及其表達(dá)量篩選適合的宿主細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

2.1.1 細(xì)胞的篩選馴化和保藏 實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)首先需要選擇合適的宿主細(xì)胞，細(xì)胞系的特征直接影響放大的可能性以及放大技術(shù)的選擇。同一種細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)時(shí)對(duì)同一病毒的敏感性不同;同一株細(xì)胞不同的克隆對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件有不同的需求，對(duì)病毒敏感性亦可能不同。

通常根據(jù)毒株特性，綜合考慮所用毒株能在何種細(xì)胞上增殖、表達(dá)，懸浮或貼壁細(xì)胞屬性是否適合大規(guī)模培養(yǎng)，規(guī)模和技術(shù)是否影響表達(dá)的穩(wěn)定性，能否進(jìn)行馴化，馴化后毒株的敏感性和表達(dá)量是否有變化等因素選擇合適的宿主細(xì)胞。細(xì)胞和毒株的篩選馴化非常重要，尤其對(duì)于貼壁細(xì)胞，因微載體懸浮培養(yǎng)比全懸浮培養(yǎng)成本高，所以一些國(guó)際知名企業(yè)對(duì)Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞及PER－C6細(xì)胞進(jìn)行懸浮化［8－9］培養(yǎng)并已獲成功。

細(xì)胞篩選馴化的實(shí)質(zhì)是應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，在降低細(xì)胞凋亡率、提高細(xì)胞活力、延長(zhǎng)細(xì)胞生命周期、提高產(chǎn)物濃度等方面進(jìn)行研究，結(jié)合特定細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，篩選適用于生產(chǎn)的細(xì)胞株。Lonza公司在2005年采用普通CHOK1細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染克隆篩選后的懸浮突變細(xì)胞株CHOK1SV進(jìn)行蛋白表達(dá)能力對(duì)比，發(fā)現(xiàn)篩選后的細(xì)胞蛋白表達(dá)能力提高了4～5倍［5］。Chia chu等也通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)克隆篩選出懸浮的MDCK細(xì)胞株［8］。

為實(shí)現(xiàn)馴化的穩(wěn)定，通常由高密度細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)向低密度細(xì)胞培養(yǎng)，由高濃度血清培養(yǎng)逐漸降低血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。因細(xì)胞損傷后難以修復(fù)，所以馴化時(shí)細(xì)胞活力應(yīng)保持在90%以上。細(xì)胞的增殖能力直接影響產(chǎn)能，馴化時(shí)應(yīng)保持對(duì)其增殖能力的測(cè)定。細(xì)胞馴化時(shí)還應(yīng)對(duì)其表達(dá)分泌能力進(jìn)行測(cè)定，避免馴化后的細(xì)胞表達(dá)特性發(fā)生變化。馴化后細(xì)胞的增殖能力、活力及生產(chǎn)能力要能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。由于特定細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求不同，實(shí)現(xiàn)其馴化的難易程度也不同，在馴化時(shí)需要選用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基，有針對(duì)性地補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞的特定需求，使馴化好的細(xì)胞可以保持其懸浮或是無(wú)血清生長(zhǎng)的特性。與20世紀(jì)80年代相比，由于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞馴化變得相對(duì)容易。

在篩選馴化過(guò)程中應(yīng)注意及時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保藏，以避免在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)異常情況導(dǎo)致篩選馴化工作量的重復(fù)和時(shí)間浪費(fèi)。保藏時(shí)，應(yīng)選用在該馴化條件下細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞。

2.1.2 病毒對(duì)細(xì)胞的敏感性關(guān)系 培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的目的是通過(guò)細(xì)胞制備足夠量的病毒，因此，毒株對(duì)細(xì)胞的敏感性非常重要。但在實(shí)際應(yīng)用中，毒株對(duì)細(xì)胞的敏感性、差異性較大。不同細(xì)胞對(duì)同一病毒敏感性不同，同一細(xì)胞對(duì)不同病毒株敏感性不同;懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的敏感性不同;同一病毒株可在多種宿主細(xì)胞上生長(zhǎng)，一種細(xì)胞系平臺(tái)也可能生產(chǎn)多種病毒;同一細(xì)胞不同培養(yǎng)方式的病毒量、抗原結(jié)構(gòu)、免疫原性、毒力等也可能不同。如狂犬病毒PM毒株從最初的兔脊髓制備，經(jīng)過(guò)多種(次)細(xì)胞適應(yīng)和傳代，發(fā)展到現(xiàn)在采用Vero細(xì)胞制備，使狂犬病疫苗的生產(chǎn)率明顯提高;而狂犬病毒Flury LEP株也從最初的雞胚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)發(fā)展到BHK21細(xì)胞生產(chǎn)，并進(jìn)一步適應(yīng)了反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)等［12］。

當(dāng)病毒對(duì)一些細(xì)胞基質(zhì)不夠敏感時(shí)，可以通過(guò)傳代馴化的方式，使病毒逐步適應(yīng)該細(xì)胞基質(zhì)，最終滿足生產(chǎn)疫苗的需求。

在優(yōu)化培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上，作為種源的毒株及相應(yīng)細(xì)胞株的篩選優(yōu)化，提高細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和病毒表達(dá)量已是當(dāng)前提高產(chǎn)率的一個(gè)技術(shù)要點(diǎn)，也是降低成本、提高生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵之一。諾華公司采用來(lái)自于ATCC的血清依賴型MDCK細(xì)胞株進(jìn)行馴化篩選，形成了在無(wú)血清無(wú)蛋白條件下懸浮培養(yǎng)的流感病毒專用MDCK細(xì)胞株［9］。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)基的個(gè)性化和優(yōu)化 瑞士聯(lián)邦科技學(xué)會(huì)生物工藝學(xué)教授Wurm博士在2005年即指出:“培養(yǎng)基雖不是細(xì)胞培養(yǎng)中唯一重要因素，但確是最重要的一種”［13］。尤其在大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)中，維持細(xì)胞高密度甚至無(wú)血清生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)含量對(duì)細(xì)胞的增殖、維持至關(guān)重要。在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中，不同細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝的特異性不同，細(xì)胞和病毒培養(yǎng)工藝不同，需要抗剪切力、滿足放大功能，還需要提高目標(biāo)生物制品的穩(wěn)定性、表達(dá)量，這些均需要個(gè)性化培養(yǎng)基的支持。Lonza公司2005年研究結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的限定化學(xué)成分細(xì)胞培養(yǎng)基與目錄細(xì)胞培養(yǎng)基相比，蛋白表達(dá)量提高了9.6倍［6，14］。

個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基在國(guó)外生物制品生產(chǎn)中被普遍采用，生物制藥公司往往與細(xì)胞培養(yǎng)基企業(yè)建立合同服務(wù)關(guān)系，研制最適合的個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基用于生產(chǎn)，由細(xì)胞培養(yǎng)基企業(yè)為用戶提供細(xì)胞培養(yǎng)基定制以及相關(guān)技術(shù)支持，幫助他們最大程度地提高生產(chǎn)效率［15］。為用戶定制細(xì)胞培養(yǎng)基是世界幾大細(xì)胞培養(yǎng)基制造商業(yè)務(wù)的主要部分，而公開的目錄細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品僅占其業(yè)務(wù)的10% ～30%［16］。

但是我國(guó)銷售的細(xì)胞培養(yǎng)基卻多為20世紀(jì)50年代發(fā)明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基等［15］，這些目錄產(chǎn)品難以滿足生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)要求，直接影響了生物制藥行業(yè)技術(shù)升級(jí)。

細(xì)胞培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基，發(fā)展到無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基，近百年的發(fā)展，已發(fā)生質(zhì)的飛躍。無(wú)血清培養(yǎng)基杜絕了血清的外源性污染和對(duì)細(xì)胞毒性作用，使產(chǎn)品易于純化、回收率高;其成分明確，有利于研究細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)機(jī)制;還可根據(jù)不同細(xì)胞株設(shè)計(jì)和優(yōu)化適合其高密度生長(zhǎng)或高水平表達(dá)的培養(yǎng)基［17］。從對(duì)人類和動(dòng)物安全性的長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，生物制品生產(chǎn)越來(lái)越傾向采用無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基，國(guó)際上生物制藥生產(chǎn)中，已經(jīng)有50%以上采用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基［18］。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)工藝的研發(fā) 懸浮培養(yǎng)過(guò)程技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用主要是生產(chǎn)工藝的開發(fā)和工藝過(guò)程優(yōu)化，維持細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中的作用同樣至關(guān)重要。

2.3.1 懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)工藝 懸浮培養(yǎng)技術(shù)按細(xì)胞貼壁性分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝和貼壁細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝。懸浮細(xì)胞(CHO細(xì)胞、BHK21細(xì)胞等)可以在反應(yīng)器中直接生產(chǎn)增殖，細(xì)胞自由生長(zhǎng)、培養(yǎng)環(huán)境均一、取樣簡(jiǎn)單、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細(xì)胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)需要借助微載體，細(xì)胞和球體接觸部位營(yíng)養(yǎng)環(huán)境較差，培養(yǎng)、取樣觀察及放大工藝復(fù)雜，成本高。

雖然相對(duì)于懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)工藝復(fù)雜，但與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比仍有很大優(yōu)勢(shì)，能提高生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質(zhì)量和勞動(dòng)效率，因此是貼壁細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的主要手段。巴斯德公司利用1000 L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗，Baxter公司微載體培養(yǎng)細(xì)胞工藝已達(dá)6000 L規(guī)模。

微載體對(duì)細(xì)胞附著、細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)展和重組蛋白的表達(dá)有較大影響。常見的微載體有實(shí)體的Cytodex微載體、片狀的 DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時(shí)細(xì)胞貼附于載體內(nèi)部生長(zhǎng)，表面細(xì)胞較少，難以使用細(xì)胞消化等方法將載體和細(xì)胞進(jìn)行分離，且反應(yīng)器放大工藝?yán)щy，不適合非釋放病毒的培養(yǎng)。而Cytodex比較適應(yīng)罐倒罐的反應(yīng)器放大工藝，目前報(bào)道的貼壁細(xì)胞生產(chǎn)工藝的最佳形式是機(jī)械攪拌式反應(yīng)器實(shí)體微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的工藝設(shè)計(jì)，其最佳工藝設(shè)計(jì)體現(xiàn)于高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)［15］。清大天一公司在微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞、MARC145細(xì)胞和ST細(xì)胞等工藝技術(shù)方面同樣取得了較好的進(jìn)展。

2.3.2 懸浮培養(yǎng)工藝及選擇 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝按照培養(yǎng)方式分為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)。批培養(yǎng)能直觀反映細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)、代謝變化，操作簡(jiǎn)單，但初期代謝廢產(chǎn)物較多，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高;流加培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、容易放大，應(yīng)用廣泛，但需要進(jìn)行流加培養(yǎng)基的設(shè)計(jì);灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體積小，回收體積大，產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，利于保持產(chǎn)品的活性，但操作比較繁雜、細(xì)胞培養(yǎng)基利用效率低、旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器容易堵塞等。

不同的病毒采用的培養(yǎng)方式不同，如對(duì)于分泌型且產(chǎn)品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養(yǎng)，且灌注培養(yǎng)也更適宜于微載體培養(yǎng)。同一生物制品由于其營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的不同，其生產(chǎn)工藝也可能發(fā)生變化，如BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒，低血清培養(yǎng)時(shí)采用批培養(yǎng)，接毒前需要更換無(wú)血清的維持液;而無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需換液，配合流加培養(yǎng)可能效果更好。選擇反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)工藝需要考慮細(xì)胞和病毒的關(guān)系、產(chǎn)物穩(wěn)定性、細(xì)胞培養(yǎng)基或添加物的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模等幾個(gè)因素。

2.3.3 懸浮培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)控制 選定合適的生產(chǎn)工藝后，過(guò)程控制成為關(guān)鍵。為確保細(xì)胞生長(zhǎng)在最優(yōu)環(huán)境中，需要利用反應(yīng)器的在線監(jiān)控功能控制各種運(yùn)行參數(shù)［6］。

細(xì)胞對(duì)溫度較敏感，需要采用合適的加熱或冷卻方式控制培養(yǎng)溫度在35℃ ～37℃，避免細(xì)胞受到損傷。動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)適宜的pH范圍一般在6.8～7.3之間，低于6.8或高于7.3都可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響。Lonza公司針對(duì)CHO細(xì)胞在pH值分別為7.0和7.3條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，pH 7.0時(shí)細(xì)胞密度是pH 7.3的近2倍，生產(chǎn)率是其2.5倍［19］。因此在培養(yǎng)過(guò)程中，合適的pH控制對(duì)于整體產(chǎn)率具有較大的影響。溶氧濃度控制同樣重要，其需求范圍通常為20% ～60%的空氣飽和度，在控制溶氧的過(guò)程中，應(yīng)注意通氣量，避免氣泡的破裂對(duì)細(xì)胞的損傷;同時(shí)通氣量會(huì)影響pH值，需要綜合考慮。在培養(yǎng)過(guò)程中還需要控制細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的適宜滲透壓范圍是280～320 mOsm/kg H2O左右，在使用碳酸鈉或碳酸氫鈉來(lái)控制pH值的同時(shí)，需檢測(cè)滲透壓是否在正常范圍之內(nèi)。

此外，還要進(jìn)行流加方式、灌流速率及代謝的控制等。在整個(gè)過(guò)程控制中，各個(gè)參數(shù)不是單一運(yùn)行，且相互影響，需要進(jìn)行全面控制。

2.4 生物反應(yīng)器的選擇 反應(yīng)器規(guī)模能否放大是選擇反應(yīng)器的一個(gè)重要前提，懸浮培養(yǎng)規(guī)模的放大主要通過(guò)增加反應(yīng)器體積或者增加反應(yīng)器數(shù)量，增大反應(yīng)器體積可以節(jié)省大量的配套工程及人員成本，而多臺(tái)小的反應(yīng)器雖然操作靈活［20］，但成本相對(duì)高。在國(guó)外生物制品生產(chǎn)中采用的多是較大規(guī)模的、能夠逐級(jí)放大的生物反應(yīng)器。

選擇和配置生物反應(yīng)器還需考慮和滿足生產(chǎn)工藝和產(chǎn)能需求。反應(yīng)器接口的標(biāo)準(zhǔn)化、配件提供速度及售后服務(wù)質(zhì)量等，均應(yīng)作為工業(yè)化選用生物反應(yīng)器考慮的因素，以免造成生產(chǎn)的延誤。

3 國(guó)內(nèi)懸浮培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化存在的挑戰(zhàn)和展望

3.1 國(guó)內(nèi)懸浮培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的挑戰(zhàn) 國(guó)際上反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)已廣泛用于生物制藥生產(chǎn)，且在高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建、個(gè)性化培養(yǎng)基的研發(fā)等方面不斷發(fā)展。大量新建反應(yīng)器和產(chǎn)物表達(dá)量的提高已導(dǎo)致反應(yīng)器容量過(guò)剩，發(fā)達(dá)國(guó)家市場(chǎng)出現(xiàn)飽和、向發(fā)展中國(guó)家擴(kuò)展的趨勢(shì)。各大生物制藥巨頭開始通過(guò)合作或并購(gòu)等方式進(jìn)入新興的中國(guó)市場(chǎng)。制藥巨頭賽諾菲－安萬(wàn)特看中中國(guó)兼具研發(fā)和新興市場(chǎng)這兩種特質(zhì)，在藥品研發(fā)、生產(chǎn)包括動(dòng)物疫苗等領(lǐng)域在中國(guó)進(jìn)行了大量投資;諾華公司則在2009年底，通過(guò)收購(gòu)中國(guó)第二大甲流疫苗供應(yīng)商——浙江天元生物股權(quán)，快速進(jìn)軍中國(guó)疫苗行業(yè)。

3.2 展望 應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，快速實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用只是搭建了一個(gè)升級(jí)的工藝平臺(tái)，而不是最終目的，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動(dòng)力是新藥、新疫苗、新工藝以及配套技術(shù)的創(chuàng)新。例如無(wú)血清培養(yǎng)病毒生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā)，包括無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā);利用合適的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染或馴化技術(shù)實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)構(gòu)建;新宿主細(xì)胞表達(dá)品種開發(fā)，例如同一種產(chǎn)品采用新的宿主細(xì)胞表達(dá)或是開發(fā)一種高效表達(dá)的宿主細(xì)胞適應(yīng)幾種產(chǎn)品的表達(dá);利用基因工程技術(shù)，開發(fā)更安全的疫苗品種;生物制品相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)和產(chǎn)品國(guó)產(chǎn)化，例如個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、微載體、純化裝置、佐劑等。

4 結(jié)語(yǔ)

整合行業(yè)力量，快速實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的升級(jí)換代是未來(lái)幾年我國(guó)生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。這個(gè)過(guò)程應(yīng)重視成熟技術(shù)、成功率，減少和避免時(shí)間、資金、人力等資源的浪費(fèi)，減少機(jī)會(huì)成本，搶占市場(chǎng)先機(jī)。懸浮培養(yǎng)技術(shù)的升級(jí)將導(dǎo)致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現(xiàn)明顯的集約化趨勢(shì)，有實(shí)力的企業(yè)將不斷以創(chuàng)新新藥、新技術(shù)研發(fā)為基礎(chǔ)和核心競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)借助資金實(shí)力整合制造和營(yíng)銷體系，成為真正意義上的龍頭。

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