應(yīng)用CLSI M38-A2方案測定須癬毛癬菌對抗真菌藥物敏感性

胡小平 萬喆 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科真菌室、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京100034)

須癬毛癬菌 (Trichophyton mentagrophytes，T.m)是頭癬、體癬、股癬、手足癬和甲癬的病原菌之一，是世界范圍內(nèi)第二大常見的皮膚癬菌。近年來分子系統(tǒng)學(xué)研究證實須癬毛癬菌為一復(fù)合體，包含幾個不同種的真菌。我們對44株經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的須癬毛癬菌復(fù)合體進行培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)38株屬于趾間型毛癬菌(T.interdigitale)占＞95%，6株屬于苯海姆節(jié)皮菌 (A.benhamiae)。面對眾多的抗真菌藥物，需要合適的方法來選擇藥物以指導(dǎo)臨床治療。目前國內(nèi)對絲狀真菌的藥敏試驗主要參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)于2003年頒布的產(chǎn)孢絲狀真菌抗真菌藥敏試驗方案M38-A。但此方案并未對皮膚癬菌藥敏試驗提出標(biāo)準(zhǔn)化操作。CLSI于2008年提出了M38-A2方案，此方案對皮膚癬菌的藥敏實驗條件和判讀標(biāo)準(zhǔn)作了統(tǒng)一規(guī)定，成為皮膚癬菌藥敏的標(biāo)準(zhǔn)試驗方案。因此，本實驗擬在國內(nèi)首次應(yīng)用M38-A2方案測定須癬毛癬菌的MIC，比較分離菌株的MIC值，為臨床用藥提供指導(dǎo);并驗證M38-A2方案用于須癬毛癬菌藥敏實驗的重復(fù)性和可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

菌株來源于全國南北方8個不同省市地區(qū)的臨床分離株和分離自狐貍毛的菌株共44株。44株菌接種在沙堡氏培養(yǎng)基平皿中，28℃溫箱培養(yǎng)14 d后，菌落正面為白色絨毛狀或粉末狀，反面棕黃色;小培養(yǎng)可見大小分生孢子;尿素酶試驗和毛發(fā)穿孔試驗均陽性;溴甲酚紫乳固體培養(yǎng)基上均呈II類反應(yīng)，由此初步鑒定為須癬毛癬菌。對所有菌株進行PCR擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和核糖體大亞基(LSU)D1-D2區(qū)，擴增產(chǎn)物純化測序后利用數(shù)據(jù)庫進行序列比對，對須癬毛癬菌進行分子鑒定。最終將44株菌鑒定為趾間型毛癬菌38株，無性型苯海姆節(jié)皮菌6株。

1.2 質(zhì)控菌株

BMUO0273來自美國模式菌種保藏中心ATCC22019，須癬毛癬菌質(zhì)控株來自美國模式菌種保藏中心ATCC MYA4439。

1.3 培養(yǎng)基

本研究采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基。

1.4 主要儀器和試劑

比濁儀為生物梅里埃公司 (Biomerieux Densimat)產(chǎn)品;96孔細胞培養(yǎng)板為青島阿爾發(fā)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。RPMI-1640粉 (Gibco，USA);M0PS緩沖液(三氮嗎啉丙磺酸，沃德賽斯生物公司);NaOH，DMSO(二甲基亞砜)。

1.5 抗真菌藥物

氟康唑(FLU)和灰黃霉素 (GRI)為Sigma公司;伊曲康唑(ITR)、伏立康唑 (VIR)和阿莫羅芬(AMO)均為Galderma公司;特比萘芬 (TER)為山東齊魯制藥;環(huán)吡酮胺(CIC)為Aventis Pharma;聯(lián)苯芐唑(BIF)為重慶青陽藥業(yè)。8種藥物純度為98%～100%。依據(jù)M38-A2方案配制上述藥物的儲存液，其中水溶性藥物氟康唑溶于無菌蒸餾水，其他脂溶性藥物溶于二甲基亞砜 (DMSO)。每一批儲存液均設(shè)溶劑對照。各藥物工作液濃度范圍為:氟康唑0.125～64μg/mL;伊曲康唑、環(huán)吡酮胺、聯(lián)苯芐唑、灰黃霉素0.031 3～16μg/mL;伏立康唑0.007 81～4 μg/mL;特比萘芬0.000 937～0.5 μg/mL;阿莫羅芬0.001 87～1 μg/mL。

藥敏板的配制 用16×100 mm無菌試管制備藥物稀釋液，用96孔(12×8)板進行實驗，取0.1 mL依次加入96孔板的1～10列中，第11列為生長對照，只含有0.1 mL RPMI-1640，不含抗真菌藥物，取0.2 mL RPMI-1640加入第12列作陰性對照，配制過程中每一濃度梯度完成后應(yīng)更換槍頭。配制好的藥敏板儲存在-20℃以備用。

1.6 抗真菌藥物敏感性試驗

改良真菌菌懸液制備 所有受試菌接種在PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)10～14 d使其活化，取1 mL的生理鹽水加入試管，用巴氏吸管輕輕抽吸后，將有孢子和菌絲片斷的菌懸液吸到尖端開口并帶濾紙的EP管后滲漏至另一無菌EP管，移液管轉(zhuǎn)入比濁管后用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至 (2～3)×105CFU/mL，相當(dāng)于比濁儀為0.2～0.3麥?zhǔn)蠁挝惶帲⒂醚毎嫈?shù)板計數(shù)驗證達 (2～3)×105CFU/mL。取部分菌懸液用生理鹽水稀釋100倍，吸取0.01 mL調(diào)好的接種液接種至沙堡氏葡萄糖瓊脂平皿上，將平皿于28℃ ～30℃下孵育并每日觀察有無菌落形成。

原CLSI M38-A2方案和改良后真菌菌懸液制備方法的比較 選擇ATCC MYA4439標(biāo)準(zhǔn)菌株采用原CLSI M38-A2方案菌懸液制備，將受試菌接種在PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)10～14 d使其活化，取1 mL的無菌0.85%鹽水覆蓋菌落，輕輕用移液器尖端摩擦菌落制成菌懸液。使菌懸液沉淀5～10 min，用血細胞計數(shù)器計數(shù)孢子，并調(diào)整到 (2～3)×105CFU/mL。同時對標(biāo)準(zhǔn)菌株進行改良真菌菌懸液制備 (如上所述)。

液體培養(yǎng)基的接種 將菌懸液用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍，得到相當(dāng)于2倍所需試驗濃度(1×103～3×103CFU/mL)接種菌懸液。同時將配置好的藥敏板取出室溫下融化，用多頭移液器固定吸頭后，在96孔培養(yǎng)板除第12孔陰性對照不加，其余各孔均加入100μL菌懸液，35℃靜止孵育培養(yǎng)，于96 h后觀察結(jié)果。每次試驗均應(yīng)包括質(zhì)控參考菌株。

結(jié)果判定 根據(jù)M38-A2的判讀標(biāo)準(zhǔn)肉眼判讀，伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、特比萘芬、灰黃霉素和環(huán)吡酮胺等與生長對照相比，出現(xiàn)80%以上生長抑制時作為判斷最低抑菌濃度(MIC)值的終點標(biāo)準(zhǔn)。聯(lián)苯芐唑和阿莫羅芬由于M38-A2方案未規(guī)定，我們暫規(guī)定采用肉眼觀察80%受抑作為終點判斷。每株受試菌株均重復(fù)做2次實驗。為保證結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)性，本實驗均由至少2人共同判讀。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對不同的抗真菌藥物之間的MIC值進行Kruskal-Wallis秩和檢驗;不同菌種兩兩比較的秩和檢驗采用Mann-whitney U法。

2 結(jié)果

2.1 接種量

使用比濁儀制備菌懸液的接種量和進行平皿菌落計數(shù)的結(jié)果基本一致。44株菌均在 (1～3)×105CFU/mL之間，均值為1.8×105CFU/mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株采用原CLSI M38-A2方案和改良后真菌菌懸液制備方法的MIC值比較

原方案 伊曲康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺、灰黃霉素、特比萘芬 MIC 值分別為:0.03μg/mL、0.03 μg/mL、0.5 μg/mL、0.15 μg/mL、0.002 μg/mL。

改良方案 伊曲康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺、灰黃霉素、特比萘芬 MIC值分別為:0.06μg/mL、0.03 μg/mL、1 μg/mL、0.15 μg/mL、0.002 μg/mL。兩種方案的MIC值基本接近。

2.3 8種抗真菌藥物的MIC值范圍和幾何均數(shù)

伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、阿莫羅芬MIC值較低，氟康唑、聯(lián)苯芐唑MIC值較高。8種抗真菌藥物的藥敏試驗MIC值范圍依次為氟康唑0.25～64 μg/mL，MIC90為64 μg/mL;伊曲康唑0.031 2～2 μg/mL，MIC90為 0.5 μg/mL、環(huán)吡酮胺 1 ～2 μg/mL，MIC90為 2 μg/mL、聯(lián)苯芐唑 0.031 2 ～ 4 μg/mL，MIC90為0.5 μg/mL、灰黃霉素 0.062 5 ～1 μg/mL，MIC90為0.5 μg/mL;伏立康唑0.015 6 ～0.5 μg/mL，MIC90為 0.125 μg/mL;特比萘芬 0.000 937 ～0.007 81 μg/mL，MIC90為0.003 8 μg/mL;阿莫羅芬 0.007 81 ～0.062 5 μg/mL，MIC90為 0.25 μg/mL(見表1)。

表1 不同抗真菌藥物對須癬毛癬菌藥敏試驗的MIC值(μg/mL)Tab.1 MICs(μg/mL)of different antifungal agents against Trichophyton mentagrophytes in vitro

不同抗真菌藥物對兩種皮膚癬菌的藥敏結(jié)果經(jīng)Kruskal-Wallis秩和檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)(見表2)。

趾間型毛癬菌和苯海姆節(jié)皮菌對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺和灰黃霉素的藥物敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.001)。對特比萘芬、阿莫羅芬和聯(lián)苯芐唑的藥物敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (見表3)。

表2 不同抗真菌藥物藥敏試驗MIC的平均秩次比較結(jié)果Tab.2 The MICs of different antifungal agents against Trichophyton mentagrophytes

表3 不同菌株之間抗真菌藥物藥敏試驗MIC的平均秩次比較結(jié)果Tab.3 The MICs of different antifungal agents against T.interdigitale and A.benhamiae

3 討論

2003年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (NCCLS，2005年1月才改為CLSI)提出了新的產(chǎn)孢絲狀真菌NCCLS藥敏試驗方法即M38-A方案，但該方案主要針對非皮膚癬菌設(shè)計。在經(jīng)過多次協(xié)作試驗之后，該委員會于2008年又提出了M38-A2方案，M38-A2方案在一系列一致試驗的基礎(chǔ)上給出了皮膚癬菌的試驗方法。

皮膚癬菌的生物學(xué)特性不同于曲霉、鐮刀霉等產(chǎn)孢豐富的絲狀真菌，其生長對數(shù)期較長，為10～14 d，最適生長溫度為27℃，菌絲較長，有分隔，產(chǎn)孢少，因此藥敏試驗的關(guān)鍵在于菌懸液的制備。M38-A2方案中對于皮膚癬菌菌懸液終濃度規(guī)定為(2～6)×103CFU/mL，方案中提出用約1 mL的無菌0.85%鹽水覆蓋菌落，輕輕用移液器尖端或無菌拭子摩擦菌落制成菌懸液。使菌懸液沉淀5～10 min，用血細胞計數(shù)器計數(shù)孢子，并調(diào)整到所需濃度。但在實際應(yīng)用中，往往出現(xiàn)長菌絲較多，易帶入培養(yǎng)基，孢子數(shù)較少而難于計數(shù)的情況。本實驗室曾經(jīng)采用研磨的方法，使較長菌絲變短來制備菌懸液，也有很多研究采用特殊培養(yǎng)基及多次純培養(yǎng)促進分生孢子大量產(chǎn)生［1］，但這些方法均過于費時繁瑣。本試驗用1 mL的生理鹽水直接沖打菌落表面后，用巴氏吸管輕輕抽吸后，將有孢子和菌絲片斷的菌懸液吸到尖端開口并帶濾紙的高壓消毒EP管后滲漏至另一無菌EP管，此過程類似于San-tos等［2］采用的濾過菌絲方法，然后移液管轉(zhuǎn)入比濁管，用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至 (2～3)×105CFU/mL，相當(dāng)于比濁儀為0.2～0.3麥?zhǔn)蠁挝惶?，并用血細胞計?shù)板計數(shù)驗證達(2～3)×105CFU/mL。抽取菌懸液稀釋后接種計數(shù)，發(fā)現(xiàn)菌量符合方案對皮膚癬菌接種量的要求。用此方法得到的菌懸液既保證接種液不含培養(yǎng)基，又濾過了較長粗大菌絲而便于孢子計數(shù)和比濁，在今后的工作中或只需要菌懸液濾過后比濁即可達到所需濃度。此種改良方法測得MIC值與原方案測得MIC值一致，簡單、快速、操作性強，適合于臨床實驗室推廣。

本實驗的MIC結(jié)果比較顯示，不同抗真菌藥物對須癬毛癬菌的藥敏結(jié)果差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。趾間型毛癬菌和苯海姆節(jié)皮菌對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺和灰黃霉素的藥物敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。對特比萘芬、阿莫羅芬和聯(lián)苯芐唑的藥物敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。唑類藥物如氟康唑、伊曲康唑、聯(lián)苯芐唑是目前應(yīng)用比較廣泛的抗真菌藥，我們實驗中顯示唑類藥物對須癬毛癬菌是敏感的，這和Maria等［3］的結(jié)果相似。伊曲康唑和聯(lián)苯芐唑MIC均值在0.3μg/mL左右，MIC90為0.5μg/mL左右;但氟康唑MIC值較高，其與臨床療效的關(guān)系尚需依藥代動力學(xué)特性而定。伏立康唑目前臨床主要用于治療系統(tǒng)性真菌感染，本實驗結(jié)果 MIC 均值為 0.04 μg/mL，MIC90為 0.125 μg/mL，和文獻［4］相一致，顯示出對須癬毛癬菌較好的體外抑菌活性。這些實驗結(jié)果為臨床用藥提供了一定的參考價值。特比萘芬、阿莫羅芬均為殺菌劑［5］，MIC 值較低，MIC90分別為0.003 8 μg/mL和0.25μg/mL，而且在對趾間型毛癬菌和苯海姆節(jié)皮菌作用上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示臨床上即使對須癬毛癬菌復(fù)合體不能進一步種內(nèi)鑒定時，治療上這兩種藥物可供優(yōu)先選擇。M38-A2方案中未規(guī)定聯(lián)苯芐唑和阿莫羅芬的判定終點，我們采用和對照相比80%受抑制作為MIC判定標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)試驗顯示結(jié)果穩(wěn)定。另外，本研究中氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺和灰黃霉素等抗真菌藥物對趾間型毛癬菌MIC值要低于對苯海姆節(jié)皮菌的MIC值，是否提示以狐貍為宿主的苯海姆節(jié)皮菌活力更強需要進一步驗證。藥敏試驗顯示，苯海姆節(jié)皮菌對氟康唑和伊曲康唑的MIC值均較高，可能出現(xiàn)不敏感現(xiàn)象，提示狐貍毛為宿主的苯海姆節(jié)皮菌一旦感染人類，在藥物選擇上要多加注意。

本研究完全按照M38-A2方案的步驟對同一實驗菌株實施2次以上的體外藥敏試驗，所得MIC值結(jié)果基本相同，驗證了M38-A2方案的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本實驗中質(zhì)控株為近平滑念珠菌ATCC22019和須癬毛癬菌ATCCMYA4439，所有藥敏試驗批次均設(shè)質(zhì)控，保證了同等條件下結(jié)果的一致性，從而保證了結(jié)果的可信性。

致謝:新疆醫(yī)科大學(xué)一附院、中山大學(xué)第二醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院等單位真菌室饋贈菌株。

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