SPE-HPLC法測(cè)定大鼠血漿中的大黃素及藥物動(dòng)力學(xué)研究

徐會(huì)平， 馮素香，*， 李建生， 屈凌波，3， 李建軍

（1.鄭州大學(xué)，河南 鄭州450001；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008；3.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州 450001）

SPE-HPLC法測(cè)定大鼠血漿中的大黃素及藥物動(dòng)力學(xué)研究

徐會(huì)平1， 馮素香1，2*， 李建生2， 屈凌波1，3， 李建軍1

（1.鄭州大學(xué)，河南 鄭州450001；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008；3.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州 450001）

目的 建立大黃素在大鼠血漿中的固相萃取-高效液相色譜分析方法，研究大黃素在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程。方法 SD大鼠按高低劑量灌胃給藥，用SPE-HPLC方法檢測(cè)大黃素的血藥濃度，DAS2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)相關(guān)參數(shù)。結(jié)果 大黃素高低劑量的藥時(shí)曲線均呈雙峰現(xiàn)象，血藥濃度隨劑量增大有所增高，在體內(nèi)分布廣泛，但消除緩慢。結(jié)論

該方法對(duì)大黃素測(cè)定具有良好的準(zhǔn)確度、精密度以及專屬性，方法回收率在87.3% ～98.7%之間，大黃素在大鼠體內(nèi)呈一室模型。

固相萃?。桓咝б合嗌V法；大黃素；藥物動(dòng)力學(xué)

大黃是臨床常用的重要中藥，性寒、味苦，具有攻積導(dǎo)滯、瀉火、涼血、活血祛瘀、利膽退黃等功效［1］。其主要成分為大黃蒽醌類衍生物如大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚等。大黃素是中藥大黃的有效成分之一，具有瀉下、降脂、抑制血小板聚集、殺菌、止咳、解痙、降壓等廣泛的藥理作用［2］?，F(xiàn)代研究表明，大黃素等蒽醌類成分具有抗病原微生物、保肝利膽、影響胃腸道運(yùn)動(dòng)、抗癌等作用［3］。大黃苷元及其單體對(duì)腦缺血損傷后的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有明顯的阻抑作用，其保護(hù)肺損傷的作用與其拮抗炎性反應(yīng)相關(guān)［4-5］。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-高效液相色譜法，建立了大黃素血漿濃度的測(cè)定方法，為開(kāi)展大黃素的藥物動(dòng)力學(xué)研究提供快速、準(zhǔn)確、可靠的分析方法；并對(duì)其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程行了分析，為進(jìn)一步開(kāi)展該藥的藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量為（280±20）g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為1006120。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)（Waters2695 Separations Module，Waters2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；Sarterius BS210S型電子天平；BY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；MDF-U32V型超低溫冰箱（日本三洋株式會(huì)社）。

1.3 藥品與試劑 大黃素、1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：110756-200910和0829-9702）；大黃素（自制，HPLC方法測(cè)定純度為90%）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙腈（色譜純，天津市四友精密化學(xué)品有限公司）；磷酸、三氯甲烷等試劑均為分析純；娃哈哈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥方式與樣品處理

2.1.1 給藥方式與取樣 取健康的SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組。給藥前禁食12 h，自由飲水。兩組分別以50 mg/kg和20 mg/kg的劑量灌胃給藥，大黃素用0.5%的羧羥基纖維素鈉水溶液混懸。各大鼠于給藥前和給藥后0.083、0.167、0.250、0.333、0.500、0.667、0.833、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、6、10、12、24 h分別剪尾取血 0.5 mL。將不同時(shí)間采集的血樣于肝素鈉管中（內(nèi)含1%的肝素鈉0.5 μL，80℃烘干），3 000 r/min離心10 min，取上清液，于－80℃冰箱中冷凍，備用。

2.1.2 血樣處理 分別取血漿200 μL于離心管中，加入內(nèi)標(biāo) 1，8-二羥基蒽醌溶液，使內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為 0.1 μg/mL，加入4倍量的乙腈，渦旋振蕩10 min，12 000 r/min離心20 min，上清液用4倍量的0.1%的磷酸水稀釋，上活化好的3 mL的C18固相萃取小柱內(nèi)（固相萃取小柱先用3 mL的甲醇活化，再用3 mL的水平衡），用5 mL 5%的甲醇水溶液除雜，再用2 mL乙腈洗脫，洗脫液于40℃水浴上，空氣吹干，用100 μL 甲醇定容。

2.2 HPLC測(cè)定條件 色譜柱Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（博納艾杰爾科技有限公司）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水（73∶27）；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；體積流量：1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；內(nèi)標(biāo)1，8-二羥基蒽醌。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，大黃素與內(nèi)標(biāo)的色譜峰分離良好，且空白血漿對(duì)其無(wú)干擾峰。大黃素對(duì)照品加內(nèi)標(biāo)，空白血漿，空白血漿加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)，血漿樣品加內(nèi)標(biāo)的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 大黃素對(duì)照品加內(nèi)標(biāo)（A）、空白血漿（B）、空白血漿加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)（C）、血漿樣品加內(nèi)標(biāo)（D）的色譜圖

1.1 ，8 -二羥基蒽醌 2.大黃素

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精確稱取大黃素，1，8-二羥基蒽醌各2 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別配制成質(zhì)量濃度為80 μg/mL的大黃素、內(nèi)標(biāo)貯備液。采取微量稀釋法將大黃素和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品母液加到空白血漿，使大黃素質(zhì)量濃度分別為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6 μg/mL，且每一溶液中1，8-二羥基蒽醌的質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL，按血樣和組織處理項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)，以大黃素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，大黃素血樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：Y=0.564 1X+0.030 1，R2=0.999 3；線性范圍為：0.02 ～1.0 μg/mL，最低檢測(cè)限為0.02 μg/mL。

2.5 方法回收率試驗(yàn) 將大黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液加入到空白血漿中，配制成質(zhì)量濃度為 0.02、0.1、0.6 μg/mL，1，8-二羥基蒽醌的質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL的對(duì)照品血漿溶液各5份，按2.1.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，根據(jù)大黃素回歸方程計(jì)算藥物濃度，與加入值進(jìn)行比較，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率分別為 87.3%（RSD=3.01%），94.6%（RSD=2.72%），98.7%（RSD=2.84%）。

2.6 精密度試驗(yàn) 同方法回收率試驗(yàn)項(xiàng)下配制對(duì)照品血漿溶液各5份，按2.1.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，每日重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 日內(nèi)及日間精密度（x ± s，n=5）

2.7 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn) 取健康的SD大鼠20只，按2.1.1項(xiàng)下給藥取樣，并按2.1.2項(xiàng)下方法處理各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血樣并測(cè)定，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，經(jīng)DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算出主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖2 大鼠灌胃不同劑量的大黃素血藥濃度-時(shí)間曲線圖

表2 大鼠高低劑量灌胃給予大黃素后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（x ± s，n=10）

由圖2和表2可知大黃素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)呈一室模型，高、低劑量的藥時(shí)曲線均呈雙峰現(xiàn)象。高、低劑量的tmax1和 tmax2分別為 0.33 h、2.5 h 和 0.25 h、2 h，高、低劑量的Cmax1和 Cmax2分別為0.599 mg/L、0.421 mg/L 和0.295 mg/L、0.232 mg/L，高、低劑量的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有顯著性差異（P＜0.05）。血藥濃度隨劑量增大有所增高，表觀分布容積V1/F也有所增大。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以1，8-二羥基蒽醌為內(nèi)標(biāo)，采用SPE-HPLC法建立了血漿中大黃素的定量測(cè)定方法，并研究了其不同劑量的藥物動(dòng)力學(xué)。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明，該法靈敏度高，雜質(zhì)干擾少，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于生物樣品中大黃素的定量分析。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，大黃素高低劑量的t1/2（4.566±0.254、6.659 ±0.314 h），清除率 CL/F（0.601 ±0.033、0.978±0.014 L/h/kg）均表明大黃素體內(nèi)消除比較緩慢，表觀分布容積 V1/F（194.97 ±16.767、421.06 ±18.984 L/kg）較大，提示大黃素體內(nèi)分布廣泛。大黃素各劑量的藥時(shí)曲線均呈現(xiàn)雙峰，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［6-7］，可能是因?yàn)榇簏S素在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程存在腸肝循環(huán)現(xiàn)象也可能是大黃素快速分布至其他臟器后再次吸收入血，形成第二個(gè)峰所致，尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。大黃素在大鼠體內(nèi)入血較快，但血藥濃度較低，本實(shí)驗(yàn)可為與大黃素結(jié)構(gòu)相似的蒽醌類成分進(jìn)一步體內(nèi)代謝研究提供參考，有助于進(jìn)一步闡明大黃藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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R969.1

B

1001-1528（2011）07-1230-03

2010-09-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30873265）；河南省高校青年骨干教師資助項(xiàng)目（2009GGJS-065）；鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（0910SGYS33390-7）

徐會(huì)平（1985—），女，碩士生。E-mail：xuhuiping426@163.com

馮素香（1971—），女，博士生，副教授，從事中藥質(zhì)量控制與新藥研究工作。Tel：（0371）65680562，E-mail：fengsx221@163.com