HPLC法同時(shí)測定銀翹柴桂顆粒中綠原酸、芍藥苷和黃芩苷

桂蜀華， 陳 軍， 王 林， 鮑 涵， 左峻嶺， 張 軍， 賴小平， 林培政

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

HPLC法同時(shí)測定銀翹柴桂顆粒中綠原酸、芍藥苷和黃芩苷

桂蜀華1， 陳 軍1， 王 林1， 鮑 涵1， 左峻嶺2， 張 軍1， 賴小平1， 林培政1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

目的 為有效控制銀翹柴桂顆粒（金銀花，白芍，黃芩，重樓等）的質(zhì)量，建立制劑中綠原酸、芍藥苷和黃芩苷的HPLC定量測定方法。方法 色譜柱Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相 甲醇－0.1%磷酸梯度洗脫；檢測波長綠原酸和黃芩苷327 nm、芍藥苷230 nm；體積流量1.0 mL/min。結(jié)果 綠原酸、芍藥苷和黃芩苷分別在0.068 88～0.688 8 μg、0.066 96 ～ 0.669 6 μg 和 0.121 6 ～ 1.216 μg 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收實(shí)驗(yàn)平均回收率103.70%、103.31%、97.92%。RSD為1.07%、2.07% 和1.32%。結(jié)論 此法操作簡捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度好，可用于銀翹柴桂顆粒中綠原酸、芍藥苷和黃芩苷的定量測定。

銀翹柴桂顆粒；綠原酸；芍藥苷；黃芩苷；HPLC

銀翹柴桂顆粒主要由金銀花、白芍、重樓等藥材組成，有辛涼透表、清熱解毒之功效，治療甲型H1N1流感患者療效確切，可明顯緩解癥狀，縮短病程，逆轉(zhuǎn)病情發(fā)展［1］。近年來甲型H1N1流感暴發(fā)并迅速在世界范圍內(nèi)流行，對人民群眾的健康帶來了極大的威脅，給社會造成了巨大的損失［2］。制劑中的金銀花提取物具有抑菌和殺菌作用［3］，其綠原酸具抗病毒［4］、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基［5］等多種功效，白芍中的白芍總苷有抗炎鎮(zhèn)痛等作用［6］，芍藥苷具有抗炎和免疫抑制作用［7］，黃芩的黃酮類成分生物活性廣泛［8］，黃芩苷解熱鎮(zhèn)痛作用明顯［9］，此外還有抗自由基和保肝等作用［10］，為了方便控制其質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對以上3種成分進(jìn)行了測定，確?；颊叻盟幬锏陌踩行Х€(wěn)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器及試藥 島津LC-20A高效液相色譜儀，含SPD-20A檢測器，LC-20AT泵，SIL-20A自動進(jìn)樣器，DGU-205脫氣機(jī)，Lc solution工作站；Sartorius CP225D分析天平。

1.2 藥品與試劑 甲醇為色譜純（Merck公司），水為超純水，其它試劑均為分析純；對照品：綠原酸（110753-200413）、芍藥苷（110736-200934）和黃芩苷（110715-200815）購于中國藥品生物制品檢定所；銀翹柴桂顆粒批號（20100508、20100909、20100910）。

2 方法與結(jié)果

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1 色譜條件 色譜柱Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相 甲醇 －0.1 磷酸按表1 梯度洗脫；檢測波長 綠原酸和黃芩苷327 nm、芍藥苷230 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution of mobile phase

2.2 對照品溶液制備 取綠原酸、芍藥苷和黃芩苷對照品適量，精密稱定，制成每1 mL含綠原酸30 μg、芍藥苷 30 μg和黃芩苷 60 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；分別取缺金銀花、白芍和黃芩陰性樣品，同法制備陰性對照溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果表明綠原酸、芍藥苷和黃芩苷峰分離度良好，陰性無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取綠原酸、芍藥苷和黃芩苷混合對照品溶液 2、4、8、16、20 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=2 753 927.36X+613.42，r=1.000 0，在0.068 88 ～0.688 8 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1 168 625.55X+2 318.57，r=1.000 0，在 0.066 96 ～0.669 6 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2 644 754.79X+8 979.27，r=1.000 0，在0.121 6 ～1.216μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄綠原酸、芍藥苷和黃芩苷峰面積，計(jì)算其RSD 分別為0.13%、0.38%和0.29%。表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16 h進(jìn)樣，測定綠原酸、芍藥苷和黃芩苷的峰面積，計(jì)算 RSD 分別為0.76%、1.64%和1.37%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品6份，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸、芍藥苷和黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD分別為0.33%和1.23%和1.52%，結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性好。

2.8 加樣回收率測定 稱取已測定的同一批銀翹柴桂顆粒（20100508）藥粉9份，每份0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入綠原酸對照品、芍藥苷對照品和黃芩苷對照品適量，按供試品溶液制備方法制備，測得綠原酸、芍藥苷和黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算綠原酸、芍藥苷和黃芩苷平均回收率分別為103.7%、103.3%和 97.9%，RSD 分別為 1.07%、2.07%和1.32%，結(jié)果表明本方法回收率良好。見表2～表4。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（綠原酸）Tab.2 Results of recovery test（chlorogenic acid）

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（芍藥苷）Tab.3 Results of recovery test（paeoniflorin）

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（黃芩苷）Tab.4 Results of recovery test（baicalin）

2.9 樣品的測定 取3批銀翹柴桂顆粒樣品（20100508、20100509、20100510），照供試品溶液制備方法制備，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算綠原酸、芍藥苷和黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.5 Determintion results of samples （n=3）

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)考察了回流和超聲提取，結(jié)果兩種方法效果相近，因超聲提取方法簡便，確定超聲提取。溶媒考察了甲醇、50%甲醇和70%乙醇［11］，結(jié)果70%乙醇對3種成分提取均較好。以70%乙醇為溶媒，提取時(shí)間考察了15、30、45 min，結(jié)果30 min時(shí)3種指標(biāo)成分已基本提取完全，因此提取時(shí)間采用30 min。

3.2 為保證各指標(biāo)成分得到良好分離，流動相考察了甲醇-水系統(tǒng)、甲醇－0.1%磷酸和甲醇－0.4%磷酸［12］，結(jié)果以甲醇－0.1%磷酸為流動相時(shí)各成分得到了良好分離；黃芩苷比較了280 nm和327 nm檢測波長［13］，結(jié)果327 nm基線比280 nm平穩(wěn)，所以優(yōu)選327 nm。

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Determination of chlorogenic acid，paeoniflorin，and baicalin in Yinqiao Chaigui Granules by HPLC

GUI Shu-hua1， CHENG Jun1， WANG Ling1， BAO Han1， ZUO Jun-ling2， ZHANG Jun1， LAI Xiaoping1，LIN Pei-zheng1

（1.Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China；2.The First Hospital Affiliated to Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China）

AIMTo explore a method for simultaneously determining chlorogenic acid，paeoniflorin，and baicalin in Yinqiao Chaigui Granules（Lonicerae japonical Flos，Paeoniae Radix alba，Scutellariae Radix，Paridis Rhizoma，etc.）.METHODSThe Kromasil C18column（250 mm ×4.6 mm，5μm）was used with methanol-0.1%phosphoric acid as the mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was set at 327 nm and 230 nm.RESULTSThe linear range of chlorogenic acid was 0.068 88-0.688 8 μg，and the average recovery was 103.70%，RSD was 1.07%.The linear range of paeoniflorin was 0.066 96-0.669 6 μg ，and the average recovery was 103.31%，RSD was 2.07%.The linear range of baicalin was 0.121 6-1.216 μg，and the average recovery was 97.92%，RSD was 1.32%.CONCLUSIONThe method is rapid，convenient，accurate，and can be used to control the quality of this preparation.

Yinqiao Chaigui Granules；chlorogenic acid；paeoniflorin；baicalin；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2011）07-1175-04

2010-12-14

國家“十一五”支撐計(jì)劃（BAI2006B0105）

桂蜀華（1972—），女，博士，副研究員，研究方向：中藥新藥研究與開發(fā)。Tel：13631396525，E-mail：gj1615@sohu.com