毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定三白草中蘆丁和槲皮素的含量

馮海燕， 李向軍， 牛立芬， 武 戈， 張 萍

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊 050035;2.中國科學(xué)院研究生院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，北京 100049)

三白草為三白草科植物三白草Saururus chinensis(Lour)bail的干燥地上部分，具有清熱解毒、利水消腫之功效［1］，是一種治療小便不利、淋瀝澀痛、尿路感染、腎炎水腫的常用中藥，主要分布在我國中南、西南地區(qū)［2］。研究表明，三白草含揮發(fā)油、黃酮、鞣質(zhì)等成分［3-4］。由于黃酮類化合物是中草藥有效成分之一，研究三白草中黃酮類化合物的含量將有助于探索有效成分與療效間的關(guān)系。已有的文獻(xiàn)報(bào)道，中草藥及中成藥中黃酮類化合物的測(cè)定主要采用高效液相色譜法(HPLC)［5-11］，將毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)應(yīng)用于三白草中黃酮類化合物的分析測(cè)定還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳測(cè)定三白草中兩種黃酮類化合物—蘆丁和槲皮素的新方法，為三白草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

CL1030高效毛細(xì)管電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司);石英毛細(xì)管(50cm×50μm，有效長(zhǎng)度為41 cm，河北永年光導(dǎo)纖維廠);S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA 2204 B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DELTA 320 pH計(jì)(梅特勒—托利多儀器有限公司);蘆丁、槲皮素(中國藥品生物制品檢定所);三白草(安國冷背藥材有限公司，經(jīng)本學(xué)院生藥教研室馮俊霞老師鑒定);所用其他試劑皆為分析純;水為二蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

對(duì)照品溶液 精密稱取槲皮素對(duì)照品19.9 mg，蘆丁19.6 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得1.99 mg/mL槲皮素貯備液、1.96 mg/mL蘆丁貯備液。

供試品溶液 取干燥三白草藥材，粉碎過18目篩，取約5.0 g樣品，精密稱定，加入60%乙醇100 mL，在不同溫度(35℃、45℃、55℃、65℃、75℃)下超聲萃取30 min，萃取液抽濾，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容至100 mL即為供試品溶液。

2.2 電泳條件

運(yùn)行緩沖液:15 mmol/L硼砂溶液(pH 8.5);重力進(jìn)樣:10 cm，12 s;分離電壓:28 kV;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。毛細(xì)管柱使用前以1 mol/L NaOH、二蒸水和運(yùn)行緩沖液各沖洗10 min，兩次電泳之間以二蒸水、0.1 mol/L NaOH、二蒸水和運(yùn)行緩沖液依次沖洗2、3、4、5 min。所有溶液使用前均經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并超聲脫氣。

3 結(jié)果與討論

3.1 電泳條件優(yōu)化

3.1.1 緩沖溶液濃度

在5～30 mmol/L范圍內(nèi)考察硼砂濃度對(duì)分離的影響。隨硼砂濃度的增加，槲皮素和蘆丁的遷移時(shí)間增加，分離度提高，但焦耳熱效應(yīng)和基線噪聲也隨之增加，實(shí)驗(yàn)選擇15 mmol/L的硼砂緩沖溶液。

3.1.2 緩沖溶液pH

在8.0～10.0范圍內(nèi)考察緩沖液pH對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。當(dāng)緩沖液pH值較低時(shí)，蘆丁、槲皮素間分離度較差，不利于定量;高于8.5時(shí)，隨緩沖液pH值增加，分析物遷移時(shí)間增長(zhǎng)，分離度提高;但當(dāng)pH值高于9.0時(shí)，槲皮素峰形變差。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)隨著緩沖液pH值的增大，分析物峰高呈下降趨勢(shì)，尤其當(dāng)pH值高于9.0以后下降趨勢(shì)更加明顯。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選擇pH 8.5的緩沖溶液。

3.1.3 進(jìn)樣時(shí)間

在4～14 s范圍內(nèi)考察進(jìn)樣時(shí)間對(duì)峰高的影響。隨進(jìn)樣時(shí)間增加，峰高增加，但當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過14 s以后，峰高變化不再明顯，實(shí)驗(yàn)選擇12 s的進(jìn)樣時(shí)間。

3.2 樣品提取方法考察

試驗(yàn)選用超聲波提取法與加熱回流法來處理樣品，用70%乙醇超聲處理30 min與加70%乙醇回流提取2次每次120 min［12］進(jìn)行比較。結(jié)果兩者呈不明顯的區(qū)別，用超聲波提取法更方便快捷，符合分析的需求。

3.3 線性關(guān)系考察

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，兩種分析物在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離(譜圖見圖1A)。用運(yùn)行緩沖液分別稀釋槲皮素和蘆丁貯備液，即得一系列濃度的對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣，考察兩種分析物的線性關(guān)系。以譜圖中各峰峰高(Y)為縱坐標(biāo)，分析物濃度(X)為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，槲皮素的回歸方程為:Y=269.396+86.899X，r=0.999 6(n=7)，線性范圍為2.0～200 mg/L;蘆丁的回歸方程為:Y=115.350+49.940X，r=0.999 3(n=7)，線性范圍為0.5～100 mg/L。

圖1 對(duì)照品(A)和三白草(B)的毛細(xì)管電泳色譜圖Fig.1 Electropherograms of standard(A)and Saururaceae Chinensis(Lour)Bail sample(B)

3.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取含兩種分析物各50 mg/L的對(duì)照品溶液，按上述電泳條件，分別進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，以槲皮素的遷移時(shí)間和峰高計(jì)，RSD分別為1.83% 和2.73%;以蘆丁的遷移時(shí)間和峰高計(jì)，RSD分別為1.98%和2.57%。

3.5 重復(fù)性考察

精密稱取三白草藥材5份分別制備供試品溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行電泳分析。結(jié)果槲皮素峰高的RSD為2.99%，蘆丁峰高的RSD為3.19%，表明方法的重復(fù)性良好。

3.6 回收率測(cè)定

向已知蘆丁和槲皮素含量的供試品溶液中，加入低、中、高濃度的對(duì)照品溶液，按上述選定試驗(yàn)條件做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。槲皮素的平均回收率為97.2%，蘆丁的平均回收率96.0%，說明所建實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

3.7 樣品分析

按2.1項(xiàng)制備不同超聲溫度下的三白草供試品溶液，利用所建電泳方法，測(cè)定供試品中槲皮素和蘆丁的含量，根據(jù)遷移時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)加入法定性，電泳圖見圖1B，結(jié)果見表1和表2。

表1 槲皮素的分析結(jié)果(n=5)Tab.1 Analytical results of quercetin in sample(n=5)

表2 蘆丁的分析結(jié)果(n=5)Tab.2 Analytical results of rutin in sample(n=5)

不難看出，在三白草藥材中，蘆丁含量較高，而槲皮素含量較低，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道［5，7-8］相一致;且隨著超聲溫度的升高，兩種分析物的含量不同程度地增加:槲皮素含量增加緩慢，在溫度高于55℃時(shí)基本不變，這可能因?yàn)槿撞葜虚纹に睾枯^低，溫度較低時(shí)萃取已近完全;而對(duì)于蘆丁，隨溫度的升高含量增加較為明顯，在溫度達(dá)到65℃以后才開始變緩，由此得出欲使三白草中槲皮素和蘆丁更大程度地溶出，在所選定的提取條件下超聲溫度應(yīng)控制在65℃以上。

4小結(jié)

本試驗(yàn)建立了測(cè)定三白草中蘆丁和槲皮素含量的毛細(xì)管電泳方法，與文獻(xiàn)［5，8］的HPLC相比，本法簡(jiǎn)便快速，5 min內(nèi)即可完成對(duì)樣品的測(cè)定，大大縮短了分析時(shí)間;與文獻(xiàn)［6-7］的HPLC相比，本法采用水溶液作為背景電解質(zhì)，對(duì)環(huán)境友好，污染小，且上機(jī)前不需樣品預(yù)處理過程。利用所建實(shí)驗(yàn)方法還對(duì)不同提取溫度下三白草中槲皮素和蘆丁的提取效果進(jìn)行考察，結(jié)果表明槲皮素和蘆丁的含量均隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度高于65℃時(shí)增加變緩，這將對(duì)三白草中黃酮類物質(zhì)的提取起到一定的指導(dǎo)作用。

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